分子生物学基本实验操作.pptxVIP

第1页/共54页分子生物学基本实验操作第2页/共54页HEADLINE核 酸 抽 提12PCR 技术克 隆 操 作34实验中一些好的习惯第3页/共54页1 核酸抽提 1.1 总RNA抽提 1.1.1 原理 利用强变性剂异硫氰酸胍迅速裂解组织（或细胞），促使核蛋白与核酸的解离，并迅速抑制细胞内的RNA 酶；经酸性苯酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀可获得完整的RNA。 第4页/共54页1.1.2 相关器皿的处理 1.1.2.1 塑料制品的处理 已经标明RNase-Free的塑料制品，如果没有开封使用过，可以直接使用。对于国产塑料制品，都必须处理方可使用，步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入双蒸水，加入DEPC使其终浓度为0.1%，磁力搅拌0.5小时；2）用1）浸泡需要处理的塑料制品，在通风橱中处理过夜；3）弃将DEPC水，用铝箔封住处理过的塑料制品，高温高压灭菌至少30 min；5）100℃烤至干燥，置于干净处备用。枪头必须在无菌操作台中，用镊子装入枪头 盒。第5页/共54页1.1.2.2 玻璃和金属制品的处理 用去离子清洗干净，用锡箔纸包好，然后至烘箱中250℃烘烤3小时以上 或者180℃烘烤8小时以上。 1.1.2.3 电泳槽的处理 用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满 3%的H2O2溶液，于室温放置 10 分钟，最后用 0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽。第6页/共54页1.1.2.2 其他 RNA酶很难被灭活，实验过程中要时刻注意防止RNA酶污染。 实验操作者的手也是RNA酶最主要的潜在污染源之一，因此，在实验准备和RNA抽提过程中，都应戴手套，并尽可能勤换手套。 实验室RNA相关实验用的仪器及试剂应该专用，包括移液器、玻璃器皿、塑料制品和电泳槽等，并存放在指定地点。第7页/共54页1.1.3 总RNA抽提步骤质 量 检 测匀 浆溶 解相 分 离沉 淀洗 涤第8页/共54页1.1.3.1 匀浆米粒大小的组织加入100微升Trizol ，冰上充分研磨至看不见块状的组织，再补加900ul Trizol 至1ml（适用肝、肾等组织） 研磨棒组织用液氮预冷研钵，将绿豆大小的组织直接置于液氮中敲碎，并迅速研磨至粉末状，小心转移至1ml Trizol中。在研磨的过程中，应不断补加液氮，直至样品成粉末状（适用于心、胃、主动脉等组织） 液 氮匀浆倾去培养基，按10cm dish /ml的比例直接将Trizol加入到培养皿中消化、裂解细胞，用RNAse free的枪头吹打数次，将样品转入无RNA酶的EP管中贴壁细胞细胞4℃ 2 000g 离心5分钟收集细胞，用Trizol重悬、裂解，每1ml Trizol可裂解5-10*106个细胞 悬浮细胞第9页/共54页1.1.3.2 相分离（1）匀浆好的组织，室温下静置5-10 min以充分裂解，4℃、16000rpm离心10min， 取800微升上清液转入一个无RNA酶的EP管中；若为细胞样本，可以省略此步， 直接进行下一步操作；（2）按照1ml Trizol加入200μl氯仿，用手剧烈振荡混匀15-30S后室温静置10-15 min， 直至出现较为明显的分层；（3）4℃，16000 r/min离心15 min，小心吸取上层水相于一新管。 *千万不可吸取到中间界面，一般吸取300微升上清，所得RNA产量足以进行一般的 后续实验，过多上清很容易造成DNA污染；第10页/共54页1.1.3.3 RNA沉淀(4) 加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min；(5) 4℃，12000 rpm离心10min，弃上清，此时可见RNA沉淀于管底。在离心之前， RNA沉淀是不可见的，常常在离心管的边缘或者底部形成凝胶状小球；1.1.3.4 RNA 洗涤、溶解（6） 加入1ml 75%DEPC-乙醇，悬浮沉淀； * 此步一定要将RNA沉淀悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去（7）4℃，12000 rpm离心5 min，弃上清，室温晾干，或者真空干燥5~10 min，视 沉淀量的多少加入DEPC- ddH2O溶解RNA，可用枪吹打数下以助RNA溶解； * 沉淀不要过于干燥，否则将会大大降低RNA的溶解度；第11页/共54页1.1.3.5 RNA质量检测（1）完整性：可以用普通琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。电泳所用的缓冲液 必须是新配置的。如果电泳可见28S和18S两条主要条带，以及5S的带，并且 28S的亮度在18S的两倍以上，认为RNA的质量很好。 * RNA上样量应控制在300-400ng左右，过多或过少都影响电泳效果第12页/共54页1.1.3.5 RNA质量检测（2）纯度和产量分析：计算A260/A280的比值R来判定RNA的纯度： 用DEPC- ddH2O溶