双酶切及连接.pptxVIP

双酶切及连接第1页/共20页 目录原理类型命名法实验注意事项连接常见问题及对策第2页/共20页 DNA的限制性酶切实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。第3页/共20页 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。限制性内切酶的类型第4页/共20页 限制性内切酶的类型第一类（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第5页/共20页 第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。限制性内切酶的类型第6页/共20页 第三类（Ⅱ型）限制性内切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。 限制性内切酶的类型第7页/共20页 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。第8页/共20页 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’3’…… CTA|TAG …… 5’ 　切割后形成5’…… GAT ATC …… 3’3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：第9页/共20页 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。 限制性核酸内切酶的命名法第10页/共20页 实验材料及仪器 高速离心机，电炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪头，Ep管，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，质粒DNA第11页/共20页 双酶切无菌水0.8μL10x缓冲液2μL质粒16μLBgl I0.6μLSal II0.6μL共20μL 按如下体系加入到0.5ml离心管中加体系离心37℃ 水浴1h跑电泳第12页/共20页 结果第13页/共20页 结果与分析 质粒的双酶切没有出现结果但marker出了条带说明胶没有问题，而PCR的酶切产物出现了较好的实验结果。第14页/共20页 １．内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定。同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。五、注意事项——限制性内切酶酶切第15页/共20页 连接反应DNA 分子的体外连接（重组）是指外源 DNA 片段和载体 DNA 分子在体外通过 DNA 连接酶共价连接。 DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的 5磷酸和3羟基间可由联接酶催化形成磷酸二酯键，即能完成联接反应。第16页/共20页 连接体系10× Buffer2.5μL载体1μLDNA10μLT4酶1μL无菌水