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克隆操作中使用的工具酶1第1页/共53页第2页/共53页第一节 基因操作工具酶第3页/共53页基因工程操作中最常用的工具酶酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ S1核酸酶Klenow酶DNA酶Ⅰ Taq DNA 聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶第4页/共53页主要内容1 限制性核酸内切酶2 DNA连接酶3 DNA聚合酶4 修 饰 酶5 小 结第5页/共53页酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 或Klenow酶制作DNA探针. 合成cDNA第二链； 填补双链DNA 3`凹端；DNA测序。Taq DNA 聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶Ⅰ在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶合成cDNA ，或补平反应制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基HomeSUMMARY第6页/共53页1 限制性核酸内切酶1.1 引 言1.2 命 名1.3 分 类1.4 活性及影响因素Home第7页/共53页 1.1 引言—两个概念核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。（1）按作用对象分: DNAase RNAase（2）按断裂核酸分子不同方式分： Endonuclease Exonuclease第8页/共53页限制性内切核酸酶（restriction endonuclease): 指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。 限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-Modification System)。Back1.2命 名第9页/共53页命名原则：第一个字母（大写, 斜体）： 该酶来源的微生物属名；第二、三个字母（小写、斜体）：微生物种名；若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为EcoRⅠ， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（coli)，R 代表株系（RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。Back第10页/共53页1.3 分 类1.3.1Ⅰ 型限制性内切酶1.3.2 Ⅱ 型限制性内切酶1.3.3Ⅲ 型限制性内切酶Back第11页/共53页1.3.1 Ⅰ型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，无固定切割位点；应用：不常用。Back第12页/共53页1.3.2 Ⅲ型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在距识别位点3`端24-26 bp处。应用：数量很少，无实际作用。Back1.3.3 Ⅱ型限制性内切酶第13页/共53页功能：识别并特异切割DNA分子。 即通常所指DNA限制性核酸内切酶；反应特点：仅需 Mg2+ 作催化反应辅助因子，能识别双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异片段；应用：种类繁多，分子克隆中最为常用第14页/共53页(1) 基本特性识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5切割产生末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC ↓GGG)第15页/共53页Recognition Sequences and Cutting sites of Restriction Endonucleases EnzymeRecognition seuqenceEnzymeRecognition seuqenceBamH IG↓GATCCPst ICTGCA ↓GBgl II A ↓GATCTSal IG ↓TCGACEcoR IG ↓AATTCSau3A I↓GATCHind IIGTPy ↓PuACSfi IGGCCNNNN ↓NGGCCHind IIIA ↓AGCTTSma ICCC ↓GGGKpn IGGTAC ↓CXba IT ↓CTAGANot IGC ↓GGCCGCXho IC ↓TCGAG第16页/共53页(2) 同功异源酶(isoschizomer) 来源不同但