农杆菌介导的植物转基因技术.ppt

农杆菌介导的植物转基因技术 第1页，共15页。 一、转基因植物概述 转基因辣椒 转基因玉米 转基因玫瑰 日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。 第2页，共15页。 1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理； 2、掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术 的操作流程。 二、实验目的 第3页，共15页。 根癌农杆菌，属根瘤菌科，为革兰氏阴性。根癌农杆菌感染双子叶植物时，可在被感染的伤口形成冠瘿瘤,诱导有关的质粒为Ti质粒 。Ti质粒上有一段T-DNA区，人们将外源基因插入到T-DNA区，借助农杆菌的感染使携带外源基因的T-DNA区转入植物基因组中，从而实现外源基因向植物细胞的转移和整合。 三、实验原理 T-DNA 第4页，共15页。 1、仪器：超净工作台，离心机，恒温摇床，组织培养室； 2、试剂：农杆菌EHA105，YEB培养基，MS液体培养基，共培 养基（MS+6-BA+NAA），分化培养基（MS+6-BA） 生根培养基（MS+IBA+NAA）； 3、材料：红花无菌苗。 四、实验仪器与试剂 phaT 35S R B NOS(A) Bar Target gene NcoI kpnI HindIII speI L B phaP PstI XmnI 改造后的农杆菌的T-DNA区，含有目的地基因和Bar筛选基因 第5页，共15页。 五、实验方法 （一）农杆菌菌液的制备?? 用牙签蘸取农杆菌，在YEB培养基上划线，达到纯化农杆菌的目的。 第6页，共15页。 （二）制备工程菌（摇菌）? 用牙签挑取划线得到的单菌落，将其置于YEB液体培养基中，进行液体振荡培养，28℃,180rpm，制备用于侵染转化的工程菌。 第7页，共15页。 将农杆菌离心，2000 rpm，10min，收集菌体,目的是去除细菌培养基的高浓度盐。 （三）离心，收集菌体 第8页，共15页。 （四）重悬菌体 用液体MS培养基将菌体用移液枪吹打起来，使菌体重新悬浮，其目的是减少细菌培养基对植物体的伤害。 第9页，共15页。 将预培养的红花子叶放入 菌液中浸染8-25min，在侵染过 程中轻轻摇晃，确保菌液充分进 入到红花子叶中。 （五）侵染转化 第10页，共15页。 取出外植体，将其放在无菌滤纸上，充分吸干菌液，避免菌液残留在红花子叶上，使其在培养过程中，菌液过量生长。 （六）除菌 第11页，共15页。