猪冷冻精液技术研究.docx

猪冷冻精液技术研究 夏天 高金銮1付光栋2姚德成3黄江春3陆肖芬′陈杰 · 周三华 · 万长华2 (1. 海南(罗牛山)养猪研究所海南海口571126; 2.罗牛山畜牧公司海南海口571126: 3.罗牛山人工授精站海南海口571126 4.罗牛山新华猪场海南海口571126) 摘要：通过反复试验，选择活力0.7级以上的新鲜公猪精液，过滤后立即用BTS 液按1: 1稀释在17℃冰箱中平衡2.5～3h后，用2000g/min,离心8min, 去上清液后，用加海藻 糖的TCG 卵黄液按1:1稀释，后在0～4℃冰箱中平衡2h, 然后按体积加入甘油，甘油 最终浓度为3%,再分装至0.5ml塑料细管中，置于0℃冻箱中平衡1h, 在铝盒中距液氮 面3cm 处冷冻，结果表明，经液氮储存的猪精液在52℃水温下解冻12s, 解冻活力在0.3 级以上，输精6头母猪，共产仔55头，平均9.16头，活健仔53头，平均8.82头。 自1950年英国polge 发明冷冻精液技术以来，首先在奶牛群中普及，随后在其它牛 属动物中扩大推广，其后又在羊属动物中推广。但在猪群的推广较少见，猪的精液量很 大(平均为170ml) 且不易冷冻，几十年来，虽有研究报导，但受胎率低、产仔数少，应 用极不普遍。近年来国外种猪公司，虽有少量应用，但其价格昂贵不易推广应用，国内 目前虽有多家院校进行研究，但至今无一家正式应用于生产。 为了海南种猪事业的发展，和便于国家核心育种场交流种猪血统以及地方优良猪种特 别是濒危猪种的保护，我们从2008年开始历时5年，进行了猪冷冻精液技术的研究，现 将研究情况报告如下。 1 试验地点与材料 1.1 试验时间 2008年～2010年4月 1.2试验地点 中科院海口科学实验室、罗牛山猪人工授精站实验室、海南养猪研究所实验室、罗 牛山新华猪场 1.3试验材料 液氮、干冰、无水酒精、 -80℃低温冰箱、17℃恒温冰箱、普通冰箱、相差显微镜、 显示器、空调。BTS稀释液(自配)、TCG+海藻糖稀释液(自配)、新鲜鸡蛋黄、甘油、0.25ml、 0.5ml、2.5ml细管、秒表等。 1.4试验方法 正交试验法、以2～3个评定员凭经验评定冻后活力，记录按评定的平均值计算，0.3 以上活力为合格。随机挑选母猪作输精试验。 2试验内容与结果 2.1 探索另类冷冻技术 先进行预备试验，探索另类冷源。我们利用中科院海口科学实验室的-80℃冰箱，将 无水酒精预冷冻到-80℃,将处理好的精液装入饮料细管中，用聚乙烯醇粉封口，以及装 入生化用的耐冻塑料细管中(直径10mm 盖上盖子)浸入已预冷至于-80℃无水酒精中(酒 精的冰点为-112℃)经7次试验见表1: 试验次数 冻后活力 饮料细管 塑料安瓶 1～7次 0.00 0.00 由于降温控制不好，精液密封不严，有酒精渗入，试管口径过大，7次试验冷冻后 活力均为0.00级，但视野中仍有个别直线前进运动的精子。 2.2三种冷源的比较 为了比较另类冷源与正规冷源(干冰、液氮)的优劣，我们仍用无水酒精。无水酒 精是装入大口试管后在干冰中预冷到-78℃,所用细管为日本产正规0.25ml 冷冻精液用 细管，外面加一个料薄膜套。正交试验结果表2: 试验号 A:AGE配方中添加 B:甘油浓度 C:分装及冷源 三人评均活力评分 1 海藻糖 1 4% 3 洒精细管 0.11 2 氨基乙酸 1 4% 1 干冰颗粒 0.28 3 海藻糖卵黄 1 4% 2 液氮颗粒 0.45 1 海藻糖 2 5.5% 2 液氮颗粒 0.23 2 氨基乙酸 2 5.5% 3 洒精细管 0.00 3 海藻糖卵黄 2 5.5% 1 干冰颗粒 0.28 1 海藻糖 3 7.0% 1 干冰颗粒 0.19 2 氨基乙酸 3 7.0% 2 液氮颗粒 0.16 3 海藻糖卵黄 3 7.0% 3 洒精细管 0.10 A1 0.18 B1 0.28 C1 0.25 A2 0.15 B2 0.17 C2 0.28 A3 0.28 B3 0.15 C3 0.07 本次试验结果显示，冷冻液配方的海藻糖+卵黄液为好，三种甘油浓度以4%甘油的低 浓度为好。冷源选择以酒精细管为差，加上在干冰中预冷的无水酒精不适合大量制作猪 精液冷冻，故在后续试验中淘汰出局。 2.3配方中海藻糖剂量的优选 在冷冻保护液中，加入海藻糖是近年新发现的一项研究成果，我们先后在 TCG 冷冻 保存液中加入1.25%、1.65%两个剂量，取得了制造合格精液的目标，但也有失败的记录， 后来又进行了加入3.5g/100mlTCG 进行优选。 在每100mlTCG冷冻保护液中分别采用1.25g 、1.65g和3 . 5g 进行比较，制出合格 精液的次数为4/10、6/10、7/10。于是在TCG 配方中的加入海澡糖剂量选定