亲和层析法纯化胰蛋白酶实验内容简介.pptxVIP

第1页/共60页亲和层析法纯化胰蛋白酶实验内容简介第2页/共60页 1 内容摘要 亲和层析包括了一整套复杂的底物及其配体与生物大分子之间相互作用时所形成的独特的生物学特性。在亲和结合的过程中涉及到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等因素的影响。 亲和层析的概念可以理解为配基以共价键的形式与水不溶性固体载体共价结合， 形成具有高度专一性的亲和吸附剂。以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂的混合物中有针对性分离某一种成分。第3页/共60页 本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的，从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化，酶活性的测定等内容。 通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。第4页/共60页 2实验目的方法 掌握蛋白质分离纯化的基本原理与操作技术 掌握亲和层析的基本原理及亲和介质合成技术 掌握胰蛋白酶活性及抑制活性测定的原理和方法 掌握消光系数法测定蛋白质的原理及计算方法第5页/共60页1. 3实验流程? 鸡蛋清 Spharose 4B 猪胰脏 ↓ ↓ ↓ 提取 ↓活化 提取 分离纯化 ↓ ↓ ↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液 ↓ ↓ 偶联 激活 ↓ ↓ CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液 ↓ 亲和层析 ↓ 酶促动力学 ← 纯胰蛋白酶 → 酶活性测定 ↓ 酶蛋白含量测定第6页/共60页1. 4要求掌握的技术 柱层析技术 Sephadex G-25 分子筛层析 DEAE-Cellulose 离子交换层析 CHOM –Sepharose 4B 亲和层析 蛋白质提取技术 10%TCA 提取鸡卵粘蛋白 3.5%乙酸,pH 3.0提取胰蛋白酶原?蛋白含量测定技术 消光系数法测定胰蛋白酶含量 消光系数法测定鸡卵粘蛋白含量第7页/共60页生物活性测定 胰蛋白酶比活性测定 鸡卵粘蛋白抑制活性测定? 亲和介质合成技术 载体-Sepharose 4B的前处理 载体 -Sepharose 4B的活化 活化载体-Sepharose 4B的偶联第8页/共60页第二部分 实验方法?实验一 鸡卵粘蛋白的分离纯化 1鸡卵粘蛋白的基本性质 1.1鸡卵粘蛋白的组成 分子量: 28000Da 分子组成: 四个分子量相近的亚基组成糖蛋白 糖基部分: D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸第9页/共60页1.2化学稳定性 耐热: 在80℃条件下,理化性质不发生改变 耐有机溶剂: 在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度 耐沉淀剂: 在10%的TCA的溶液中不发生沉淀. 1.3等电点性质 等电点: pI在3.9-4.5之间 溶液中的状态: 在pH3.0的溶液中稳定, 在pH8.0的溶液中容易分解 鸡卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解状态见表1。表1，鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度第10页/共60页溶液pH 值 鸡卵粘蛋白? 鸡卵清蛋白 ?等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀↑溶解↓沉淀↑溶解↓高于3.5沉淀↓溶解↑沉淀↓溶解↑??第11页/共60页1. 2.鸡卵粘蛋白的提取 2.1提取： 每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10% pH1.15 TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5± 0.2后放置4℃冰箱过夜. 2.2离心： 转移50毫升离心杯中,于3000rpm 离心15min。 2.3过滤： 倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物 2.4调pH值： 用1mol/L HCl 将溶液精确调至pH3.5。量取体积。第12页/共60页2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。 2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15min。 2.7除残留丙酮：弃