体细胞杂交的学习材料.pptxVIP

体细胞杂交的学习材料;一、体细胞杂交的概念;体细胞杂交与有性杂交的异同;;Possible Result of Fusion of Two Genetically Different Protoplasts;原生质体融合的有关名词-I;原生质体融合的有关名词-II;发展历程;1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种； 1974年，Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。;理论上，任何细胞都可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。;根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大方式： ? 对称融合（symmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。 非对称融合（asymmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。 ;用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类： ? 物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，使细胞核失活； ? 化学处理目前常用的试剂：核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。 ;二、原生质体融合; 融合方法;1. PEG诱导融合法? PEG诱导融合的特点：优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。? PEG作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键??从而在原生质体之间形成分子桥，其结果使原生质体发生粘连进而促进原生质体融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 ;融合液：CaCl2 2H2O 8~10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol pH 5.6 诱导液：融合液＋PEG 20～45％ 稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 B液 (g/100ml) pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169;P1;第18页/共49页;2．电融合法? Electrofusion, Electrically induced fusion 与PEG融合相比，电融合有三大优点： 不存在对细胞的毒害问题； 融合效率高； 融合技术操作简便。;电融合仪的结构特点： 交变电场部分 高频直流电击部分;电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起并圆球化。 ;;关于融合参数：交流电压 交变电场的振幅频率 交变电场的处理时间 直流高频电压 脉冲宽度 脉冲次数 ; 原生质体的融合过程;影响原生质体融合的因素;三、杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定; 杂种细胞的发育动态; 杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定;2．体细胞杂种鉴定 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定、染色体原位杂交 生化鉴定：同功酶鉴定