兰州地区HCV基因变异与干扰素α应答关系的探讨.pptxVIP

兰州地区HCV基因变异与干扰素α应答关系的探讨第1页/共47页 干扰素-α（interferon-α, IFN-α）有抗病毒免疫调节及诱导细胞凋亡等作用，为目前治疗丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV ) 感染的主要药物，然而有相当部分患者经IFN-α系统治疗后不能获得持久的病毒转阴。临床实验证实聚乙二醇化干扰素-α （长效干扰素-α ) 180μg/w，在48周时，病毒阴转率达到60%，而普通干扰素-α的阴转率仅19%，聚乙二醇化干扰素-α联合利巴韦林持续病毒应答率（sustained virological response, SVR）达81%。 第2页/共47页 研究显示长效干扰素-α也有20%~40%的肝炎患者存在复发和无应答状态，认为这种病例与基因变异和不同基因型的混合感染有关，为证实丙型肝炎病毒(HCV) 5’-NCR基因变异是否与干扰素-α应答有关，我们对40例1b型患者及9例干扰素-α治疗患者进行了HCV 5’-NCR基因变异研究。 已有大量的研究资料证实，5’-NCR变异与基因型相关，1型-6型之间有型特异变异特征和型特异酶切位点。我们采用1-6型通用引物扩增HCV cDNA，即可用于定性检测HCV RNA，又可用于检测基因型和1b型5’-NCR基因变异，探讨5’-NCR变异与干扰素-α治疗免疫应答的关系。 第3页/共47页 现将40例1b型 5’-NCR变异检测结果和9例干扰素-α治疗患者的5’-NCR变异检测结果汇报如下： 第4页/共47页 材料和方法一、材料 1. 40例HCV RNA阳性1b型血清，2005-2006年期间收集，-70℃保存。9例干扰素-α治疗系列血清为2007-2009年期间收集。 2. 限制性内切酶：BsrBI、Hinf I 、HaeⅡ、BstU I、Apo I 、BamH I 、Mbo I 均为Biolabs产品。 3. HCV 5’-NCR PCR扩增引物序列，按照孙南雄报道的序列合成。 第5页/共47页 材料和方法一、材料4. HCV 1b 全基因参考序列，见以下美国NCBI GenBank资料。 AB049088、AF165049、AF165050、AF165051、AF165052、AF165054、AF165059、AF165060、AF165061、AF165062、AF165063、AF165064、 D50480、 D50481、D50482、D50483、D50484、D50485、 D10750、D11168、D90208、M58335、S62220、AF165055、AF165056、AF165057、D85516、AB080299、D14853、AF054247、AF054248、AF054249、AJ132996、AJ132997、AJ238799、AF483269、AF139524，D10934、L02836、AY460204，为中国1b型全基因株。 第6页/共47页 材料和方法二、方法1. 分型方法：采用文献的HCV 5’NCR酶切分型法，对HCV RNA阳性血清分型后，选取HCV 1b型样品检测HCV 5’-NCR变异。 2. BamH Ⅰ和MboⅠ酶切方法，取产物3ul，BamHⅠ或Mbo Ⅰ5个单位，10×buffer 2ul，灭菌水15ul，总体积20ul，37℃酶切2小时。 3. HCV 5’-NCR基因变异株的检测，PAGE或2%琼脂糖胶均可。HCV 5’-NCR基因变异的判断标准：在257bp的PCR产物中，仅有Mbo Ⅰ单切点为野生株，产生2个Mbo Ⅰ切点或无MboⅠ切点及产生BamH Ⅰ切点或部分有切点、部分无切点均判为变异株。 第7页/共47页 材料和方法二、方法4. 干扰素-α治疗剂量：普通干扰素-α即IFNα-2b ，安福隆公司生产，300MU隔日一针，疗程为一年。长效干扰素-α（PEG-IFNα-2a，派罗欣），上海罗氏生产，135、180或270ug，一周一次，疗程为一年。5. 利巴韦林：所有患者均联合使用利巴韦林（利巴韦林量依据患者体重计算，10-15mg/kg/d），治疗过程中监测血红蛋白及其他不良反应。6. HCV RNA荧光定量试剂：上海实业科华生物技术有限公司的HCV核酸扩增荧光定量试剂盒，按说明书操作。第8页/共47页 结 果40例HCV 1b基因型患者5’NCR基因变异检测结果： 5’NCR基因变异类型 检出例数 百分率 仅有Mbo I单切点（野生株） 24例 60.0% 无Mbo I切点（变