分子生物学与基因工程课件-基因编辑技术.pptxVIP

基因编辑技术;靶向基因修饰;基因敲除的方法;基因编辑的三大利器;ZFN技术; DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。 核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。 ;TALE技术;TALE原理;Activators ;构建TALE与核酸内切酶FokI的融合蛋白 FokI需形成二聚体才具有活性， 因此在目标DNA中选择两处靶序列，形成TALEN对 TALE是识别靶基因，FokI则起了切割DNA的作用 特异位点打断目标基因组DNA序列，从而可在该位点进行DNA编辑修饰操作;TALEN介导的同源重组;TALEN技术需要注意的问题 ;TALEN的技术特点;;步骤二：TALEN表达质粒构建;将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14-18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 ;步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除 TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。;内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。 ;PCR–酶切法 利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，进行PCR产物酶切鉴定。 当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用核酸酶检测。 经验规律：= 2%可用，=10%很好;TALEN切割效率检测;突变体筛选;TALEN技术成功率影响因素;TALE技术应用范围;TALEN的植物应用;TALEN与主要类同技术比较;;Biotechnology: Rewriting a genome Nature?495,?50–51?(07 March 2013)?doi:10.1038/495050a;1 CRISPR-Cas概述;1 CRISPR-Cas概述;CRISPR-Cas主要由两部分组成：;1.1 CRISPR结构;1.1 CRISPR结构;1.2 Cas家族;2 CRISPR-Cas系统的发现;2 CRISPR-Cas系统的发现;2 CRISPR-Cas系统的发现;2 CRISPR-Cas系统的发现;2 CRISPR-Cas系统靶向要求;2 CRISPR-Cas系统靶向要求;2 CRISPR-Cas系统靶向要求;3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰;3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换;3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换;3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰;3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰;3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰;3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰; 2013年2月15日在《science》上发表的《Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems》一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。;3.4 实例分析 ;(A) Multiple DSBs were induced at the delta sites by CRISPR-Cas to facilitate homologous recombination of biochemical pathways at these sites. This system enabled the highly efficient single-step, markerless, and multicopy chromosomal integration of full biochemical pathways in S. cerevisiae.;(B) pDi-CRISPR also comprised of a truncated URA3promoter for increased copy numbers inS. cerevisiae, and encoded for a tracrRNA