油脂、酶蛋白基本性质测定及酶催化制备液体燃料实验方案.pdfVIP

油脂、酶蛋白基本性质测定及酶催化制备液体燃料实验 实验一 脂肪酶酶活测定 （pNPP 法）及米氏方程绘制 一、实验目的 1、了解脂肪酶酶活和米氏方程定义 2 、了解脂肪酶酶活测定的原理，掌握分光光度计测定酶活的方法 二、实验原理 脂肪酶是一类羧基酯水解酶，能够将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸或催化 其逆反应的发生。脂肪酶普遍存在于动、植物和微生物（如霉菌、细菌等） 中，是目前应用最广泛的酶制剂之一，可用于食品、药品、皮革、日用化工等 多个行业。 脂肪酶的酶活是表征脂肪酶的主要性质之一，其酶活测定方法酸碱滴定 法、对硝基苯酚法和铜皂法等。 对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester ）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广 泛的一种底物，其分子自身不显色，但经脂肪酶水解后其产生pNP （对硝基苯 酚）在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高，反应方程式 如下图所示： 脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以1 min 内催化水解底物对硝基 苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1 μmol 对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1 个酶活单位 (U) 。 三、仪器与试剂 试剂：对硝基苯酚（分析纯），对硝基苯棕榈酸酯（分析纯），异丙醇（分 析纯），乙醇（95% ），脂肪酶（自制） 仪器：分光光度计、、移液枪、电子天平、比色皿、恒温水浴锅、烧杯 四、实验操作步骤 1、pNP 标准曲线绘制： a. 标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol/L): 称取0.0279g 对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的pH=7.0 PBS 缓冲液中，置于 棕色试剂瓶内，4 ℃冰箱保存，为2mM 浓度的标准对硝基苯酚母液。（已配制 好，可直接取用，为黄色溶液，放置于离心管中） b. 标准曲线的绘制： 分别取0、2、4、8、15、23、30、45 （四舍五入取小数点后第一位加入）的 对硝基苯酚母液，分别加入62、60、58、54、47、39、32、17 μL 的异丙醇和（全 部都是）563uL 的缓冲液，40℃充分溶解 15min，然后加入 500uL 的95%乙醇， 10000rpm，3min，在410nm 下测定吸光值，绘制标准曲线 （在2mL 离心管中进 行实验）。如下表所示： 1 2 3 4 5 6 7 8 2.0mM pNP (uL) 0 2 4 8 15 23 30 45 异丙醇（uL ） 62 60 58 54 47 39 32 17 底物缓冲液（uL ） 563 563 563 563 563 563 563 563 40 ℃水浴锅内处理15min 95% 乙醇（uL ） 500 500 500 500 500 500 500 500 10000rpm 离心3min 吸光值（410nm ） 测定结束后以pNP 浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制pNP 浓度标准曲 2 线，并计算标准曲线方程和相关系数（R ）。 2、脂肪酶米氏方程的绘制 a.溶液的配制 （体系液，已由老师完成，直接取用） 溶液A: 30.0mg 对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)溶于 10.00ml 异丙醇，4 ℃棕色 瓶（或包锡箔纸的15ml 离心管）保存； 溶液B: PBS 缓冲液(pH=7.0) 100.0ml 加入1 滴TritonX-100，混匀，4 ℃保存。 b.脂肪酶活力测定 ①准备试管6 个； ②体系液取用前预先37℃水浴保温5min-10min，待析出固体完全溶解，按 照下表体积分别取0.6-2.7ml 加入6 支