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第1页/共124页n章酶的分离纯化第2页/共124页产酶方法提取分离法 微生物细胞发酵产酶酶的生产方法 生物合成法 植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶 第3页/共124页酶的提取、分离纯化细胞或其他含酶的原料提取 酶分离 酶 +杂质纯化 酶制品第4页/共124页酶的提取、分离纯化技术路线动物、植物或微生物细胞细胞破碎发酵液酶提取酶分离纯化酶浓缩离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。酶贮存第5页/共124页酶分离纯化不同阶段酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 .tw/ECX/Pur3.htm柱.tw/ECX/Pur3.htm层.tw/ECX/Pur3.htm析法。(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用.tw/ECX/Pur4.htm制备.tw/ECX/Pur4.htm式.tw/ECX/Pur4.htm电泳 或 .tw/ECX/Pur3.htmHPLC。本章目录第6页/共124页4.1细胞破碎细胞结构与酶分布胞内酶胞外酶第7页/共124页了解所分离酶在细胞中分布 细胞产生的酶有二类：1. 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容易得到。2. 在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。第8页/共124页许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。高压细胞破碎机1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎细胞破碎珠第9页/共124页细胞破碎方法及其原理捣碎法研磨法匀浆法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。机械破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 物理破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎化学破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎自溶法外加酶制剂法酶促破碎第10页/共124页 机械破碎法捣碎法:脆嫩组织细胞的破碎，也可用于微生物。研磨法：设备简单 助磨剂 常用于微生物和植物组 织细胞的破碎。匀浆法 ：匀浆器的细胞破碎程度较高，对酶的活力影响不大。细胞研磨器高速匀浆器组织捣碎机第11页/共124页物理破碎法（多用于微生物细胞的破碎）温度差破碎法：利用热胀冷缩作用 。冻融法，如革兰氏阴性菌的破碎。温度过高，易失活压力差破碎法：有高压冲击法、突然降压法及渗透压变化法。超声波破碎法：简便、快捷、效果好 。特别适合微生物细胞的破碎。 高压细胞破碎机超声波破碎仪第12页/共124页化学破碎法有机溶剂表面活性剂（离子、非离子型）细胞膜上磷脂的含量直接影响着膜的完整性和流动性（变形能力），影响着蛋白和受体的位置，进而影响酶活性和蛋白质的转运功能。 第13页/共124页酶促破碎法细胞本身的酶系外加酶制剂自溶法（autolysis） 将 细胞在一定的pH和温度条件系保温一段时间，利用细胞本身酶系作用，使细胞破坏，而使细胞内物质释出第14页/共124页革兰氏阳性菌（溶菌酶）酵母（β-葡聚糖酶）霉菌（几丁质酶）植物细胞（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶）第15页/共124页细胞对破碎方法的敏感性细胞 声波 机械 渗透压 冻融————————————————————动植物+++ +++ +++ +++革兰氏阴性菌++ ++ ++ ++革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +酵母+ + + +革兰氏阳性球菌+ - + +菌丝- ++ - ++孢子 - - - -本章目录第16页/共124页 4.2 酶的提取概念 是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。第17页/共124页提取目标： a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0-10℃）操作。第18页/共