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第1页/共65页基因操作中大分子的分离和分析第2页/共65页第四章 基因操作中大分子的分离和分析第一节 DNA的分离、检测和纯化第3页/共65页一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化1. 碱裂解法提取E.coli质粒DNA2. 通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA第4页/共65页1. 碱裂解法提取E.coli质粒DNA原理：碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。第5页/共65页由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋第6页/共65页质粒提取（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌（三）试剂：LB培养基（液体、固体）溶液I 溶液II 溶液III TE(pH8.0)第7页/共65页第8页/共65页操作步骤接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中?370C，190rpm振荡培养过夜?取1.5 ml菌液入1.5ml的离心管中 ?6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体?100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min?加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体第9页/共65页?加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性?12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管?上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）?12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管?（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）?12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管?上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min?第10页/共65页12000rpm，离心15min?沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）?12000rpm，离心10min?晾干沉淀?沉淀用20ul TE溶解，-200C保存第11页/共65页2. 通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA第12页/共65页二、电泳检测（一） DNA的琼脂糖凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺电泳（三）脉冲场凝胶电泳第13页/共65页（一）DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 第14页/共65页第15页/共65页琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围第16页/共65页核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度依次为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 第17页/共65页影响迁移率的因素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。第18页/共65页常用染料EB:溴化乙锭EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。第19页/共65页第20页/共65页SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。 第21页/共65页由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋第22页/共65页提纯和未提纯质粒DNA电泳图 第23页/共65页pGFP pBSK M第24页/共65页（二）聚丙烯酰胺电