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技术肿瘤相关抗原的筛选方法 第1页/共17页 目录 SEREX的概况 SEREX的原理 SEREX的基本流程 SEREX发现的抗原 SEREX的优点与缺点 SEREX的改进 展望 第2页/共17页 SEREX概况 中文名称：重组表达cDNA克隆的血清学分析技术 英文名称：serological analysis of recombinantly expressed cDNA clone(SEREX) 定义：用肿瘤患者血清从肿瘤细胞cDNA表达文库中筛选和寻找肿瘤抗原基因的方法。 SEREX，是1995年由德国血清学家Sahin等建立的从分子水平鉴定肿瘤抗原的方法，开创了血清学检测肿瘤抗原的新时代。 第3页/共17页 SEREX技术原理 提取肿瘤细胞或组织的mRNA，构建cDNA表达文库，用含高滴度抗体的患者血清筛选cDNA文库，经过2-3轮复筛后获得阳性单克隆。对所获得的阳性克隆经过体内删除成为噬菌粒后进行序列测定，然后对其进行生物信息学分析，再进一步展开对这些基因的结构和功能的研究。 第4页/共17页 SEREX技术基本路线 第5页/共17页 SEREX技术具体方法 cDNA表达文库的构建 从新鲜肿瘤标本或肿瘤细胞株抽提总RNA，逆转录合成cDNA后重组到噬菌体λZAP表达载体中，经体外包装后转染大肠杆菌，收集噬菌体即为cDNA表达文库。 cDNA文库的免疫筛选 从构建的cDNA文库抽取少量噬菌体，转染大肠杆菌，铺入LB培养皿，孵育过夜，次日将噬菌斑转印至硝酸纤维素膜（NC膜），接着5%脱脂奶粉（NFDM）于室温封闭NC膜1h，后用TBS液冲洗干净，用1：200经预处理的自体血清与NC膜室温孵育5-6h，再用TBS冲洗，将膜同1：3000稀释的碱性磷酸酶（AKP）标记羊抗人IgG抗体孵育1h，最后进行显色反应。挑取阳性克隆，阳性克隆再次扩增进行第2轮、第3轮筛选纯化。 第6页/共17页 SEREX技术具体方法 对阳性克隆进行DNA序列分析 在Genbank中用BLAST进行对比分析，判定该基因序列是已知还是未知，还可根据人类基因组图谱对阳性cDNA序列进行染色体基因定位。 采用Southern blot或RT-PCR检测阳性克隆cDNA在正常组织组织及肿瘤中的表达情况。 采用Northern blot检测肿瘤抗原mRNA的表达，确定肿瘤抗原的组织表达谱。 采用Western blot分析各种组织中肿瘤抗原的表达。 用已知抗原检测体内相应抗体的浓度，定量分析肿瘤特异性抗体及其临床意义。 第7页/共17页 SEREX鉴定肿瘤抗原的分类 通过SEREX方法已经在黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、小细胞肺癌、等恶性肿瘤中找到了约1500种抗原，用该方法鉴定出来的抗原按来源和性质可分为以下几类： CT抗原 分化抗原 突变抗原 过表达抗原 剪切变异体抗原 第8页/共17页 应用SEREX发现的抗原 肝癌：罗国荣等筛选出肝癌相关抗原SMP-30和Kinectin，并应用基因工程技术方法构建、表达、和纯化出肝癌相关抗原SMP-30和Kinectin的融合蛋白，采用western blot和ELISA检测出SMP-30和Kinectin相应抗体在肝癌患者血清中有较高的阳性率。 卵巢癌：王颖等发现MY-OVA-13基因；周芙玲发现12个新基因 鼻咽癌：谢可发现一个新的热休克蛋白基因家族的抗原；黄绍明发现了14个新的鼻咽癌相关抗原；舒峻筛选出16个抗原，并首次在鼻咽癌组织中筛选出金属硫2A基因 第9页/共17页 应用SEREX发现的抗原 结肠癌：Scanlan等在结肠癌中发现17个新基因 大肠癌：何敬东等筛选获得16个阳性克隆, 代表12个不同抗原基因 肺癌：Gure等发现8个抗原，以NY-LU-12抗原最重要 胰腺癌：Nakatsura等发现5个新基因高表达 白血病：Itoh等在成人T淋巴白血病中发现3个抗原 胃癌：王运伟等筛选出14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因 第10页/共17页 SEREX技术的优点 通过构建文库进行筛选 简化筛选步骤 筛选的抗原分子多为全长cDNA，可诱导细胞免疫和体液免疫，且不易导致肿瘤抗原编译丢失 cDNA文库可以来源于肿瘤组织，也可以来源于细胞系，筛选血清可以是自体血清，也可以是同源异体血清 cDNA表达克隆的血清学分析，不只限于分析肿瘤细胞的表面抗原，它涵盖了由肿瘤基因编码的大多数蛋白 将病人血清稀释后进行筛选，使得免疫分析仅限于那些可以诱导强免疫反应的抗原 使用病人多克隆抗体血清筛选，使得在一次筛选过程中，可以鉴定出多个抗原 第11页/共17页 SEREX技术的缺点 SEREX技术必须构建cDNA基因表达文库，并且仅局限于对一个或者很少几个病人血清的筛选，代表性差 SER