实验六吖啶橙染色检测细胞凋亡.pptxVIP

实验六吖啶橙染色检测细胞凋亡;实验六 吖啶橙染色检测细胞凋亡;实验目的与要求;凋亡的起始：细胞表面特化结构消失，细胞皱缩，内质网膨胀与质膜融合，染色质固缩和降解。 凋亡小体形成：细胞核分裂，与细胞质一起形成芽状突起，逐渐与细胞分离。 凋亡小体被吞噬：;第5页/共28页;吖啶橙染色原理 ;第7页/共28页;荧光显微镜;荧光显微镜的成像原理;第10页/共28页;反射荧光显微镜的构造;落射荧光显微镜各部件特性和作用;落射荧光显微镜各部件特性和作用;反射荧光显微镜原理;滤色镜的选择;滤色镜：对一定波长范围内的光线进行选择性吸收或透过的仪器。 激发滤色镜： UV:340-380nm V:390-460nm B:460-500nm G:500-570nm 分色镜：将入射光的部分波长范围的光反射，其余部分透过的反射镜。 ;滤色镜的选择;① 取细胞爬片，PBS液漂洗2次，晾干。② 95％乙醇溶液固定5 min。③ 滴加0.01％吖啶橙染液染色5min。④ PBS液临时封固(取1张干净载玻片，滴1滴PBS液，将染色好的飞片细胞面朝下放在载玻片液滴处)，⑤选择紫蓝光激发滤片，荧光显微镜观察。;观察：用蓝紫光滤光片，可见经0.01％的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(亮绿色或暗绿色、橙红色) ;反射荧光显微镜的构造;;激发荧光的方式： 按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。 UV激发法是用短于400nm的近紫外光进行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。 ; BV激发法是以404nm、434nm为中心的由紫外至蓝光进行激发。 该方法使用蓝光照射标本，所以荧光观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。;　　用于荧光抗体法的荧光色素，对于激发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较高，可得到较明亮的???像。; 其缺点是500nm以下的荧光无法看到，而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光抗体法中，大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性，所以在讨论微妙的特异性时，上述BV激发法的缺点往往影响极大。 ; 荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造和激发光的波长按以下三点考虑： ? ??? ①从荧光像的反差要求来看，UV激发暗场聚光器照明最好。 ? ??? ②以像的亮度来考虑，BV激发滤光片暗场观察效率最高。? ???; ③UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光器照明的特性，可看作介于这两种照明方法之间，但前者滤光片暗场的性质较强，显示图像较明亮，反差小；后者因保留暗场光路的性质，故显示图像较暗，而反差有所改善。当实际使用荧光显微镜时，应采用最适合标本要求的照明法进行观察。 ;感谢您的欣赏