RealtimePCR原理及其定量方法.pptxVIP

RealtimePCR原理及其定量方法;实时荧光定量PCR原理和定量方法;1、定量与常规PCR的差别;2、荧光定量PCR常用的三个概念 扩增曲线、阈值、CT值 ;（1）扩增曲线(Amplification);第6页/共52页;（2）阈值(Threshold);（3）Ct值(Cycle threshold) ;3、荧光定量PCR的数学原理; 在扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环数为Ct个循环，此时： ;; 另一种思路 由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成正比，所以可以用荧光强度来代替PCR产物的量，同时考虑荧光本底值，则： Rn= RB+ X0(1+ Ex) Rs; 类似的，当循环数n等于Ct值时，可推出： Ct lg (1+Ex) = -lg X0 + lg (RT-RB) – lg Rs 变形得: 此时，PCR反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率Ex稳定且近似相等；lg(RT -RB)、Rs也都相同，只有Ct值和-lgX0为变量，且这两个变量之间成线性关系。也就是说，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。;荧光强度---循环数曲线;4、荧光定量PCR的化学原理;非特异性荧光标记 DNA结合染料 （SYBR Green） 特异性荧光标记 探针 （Taqman、Beacon、FRET、Amplifluor） 引物 （Scorption primer、LUX primer）;（1）SYBR Green法 ;热 变 性;融解曲线（melt curve);-dI;融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确;SYBR Green法优缺点;（2）TaqMan探针法;TaqMan作用机理;TaqMan法优缺点;（3）分子信标 Beacon法;（4）FRET法;二、荧光定量PCR的定量方法;绝对定量;;绝对定量分析要素;引物设计;拷贝数计算;绝对定量实验举例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量;Sample;扩增效率E的计算 E = 10-1/斜率 －1 = 10-1/-3.29 －1 = 2.01－1 = 1.01 ;未知样品拷贝数计算：;相对定量法;相对定量分析要素;;理想的内参基因应该满足以下条件： 不存在假基因(Pseudogene) 高度表达 稳定表达于不同类型的细胞和组织，且其表达量近似，无显着性差别 表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关 其稳定的表达水平与目标基因相似 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响.;;双标准曲线法;这???，;假设检测A基因在某因子干预下的表达，得到一组数据结果如下：;2－△△Ct法;目标基因和内标基因扩增效率的快速检测;验证试验;2－△△Ct法公式推导;修正方法：如果知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正为用实际扩增效率值代替2，即E－△△Ct。 例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct;;感谢观看！