实验二PCR扩增乙肝病毒基因及.pptxVIP

实验二PCR扩增乙肝病毒基因及;分子医学技能;实验二 PCR扩增乙肝病毒基因及电泳检测  RAPD技术及基因多态性分析;;一、RAPD－PCR反应（P400）;二、 PCR试剂盒检测HBV DNA 实验操作及注意事项 ;实验分组（每组做1管待测血清，第1和6组分别做1份阳性模板） ?待测血清40ul + 40ul DNA 提取液，混匀 ? 沸水浴10min，10000rpm×5min ? 待测血清组取上清2?l加入一PCR反应管； 阳性模板组取阳性模板2?l加入一PCR反应管 6000rpm×5s，混匀 ;;三、PCR基本原理及相关知识 ;? 概 述;;? PCR扩增DNA片段的原理; ① 变性：加热，模板DNA形成两条单链 ② 退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合 ③ 延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下， 引物3-端向前延伸，合成与模板配对的新链; 上述三步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109 倍。 通过循环可以提高PCR的特异性。;第15页/共24页;? PCR反应体系的组成及功能 ; ? Taq DNA聚合酶 有良好的热稳定性，具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性.因此,它对核苷酸的错配没有校正功能。 其活性对Mg2+浓度非常敏感 终浓度一般为：2.5u/100ul; ? 模板DNA 相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。 模板用量也是很低的，一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。 ? dNTP： 已有商品化的混合液，终浓度一般为20~200umol/L。;10×PCR反应buffer： 已作成商品化的产品，它包括： 250~500mmol/L KCl； 100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；15~20mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5~2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整）； 0.1%明胶或牛血清白蛋白;? dd H2O 调节反应体积 ? 液体石蜡油 ;? 影响PCR的主要因素 ①???PCR反应体系的各个组分 ②?PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸） ③???PCR循环的次数和平台效应 ④???操作环境 ;RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术;琼脂糖凝胶板的制备???封板、梳子位置与高度、胶3mm、凝固后拔梳） ;感谢您的欣赏