基因工程制下.pptxVIP

基因工程制下;高拷贝质粒菌中质粒拷贝数增加与产物增加往往不成正比，这可能是含高拷贝质粒菌中，蛋白合成的限速步骤是转录和翻译，基因的大量复制加重了转录和翻译的负担，使得蛋白质合成速度变慢。;提高质粒稳定性的方法：;第六节 基因工程菌生长代谢的特点;采取各种方法，控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，避免乙酰辅酶A和乙酸的产生。;二、菌体生长与前体供应的关系;第七节 基因工程菌发酵;二、基因工程菌的发酵工艺;2.接种量的影响：影响发酵的产量和发酵周期，接种量小，延长菌体延迟期，不利于外源基因表达，采用大接种量，有利于缩短延迟期，并能减少污染。;4.溶氧量的影响：工程菌中外源基因的表达需要大量的能量，促进了细胞的呼吸作用，提高对氧气的需求，因此维持较高的水平的溶氧量（≥40%）才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白的表达。;可溶性蛋白，诱导后2，3，4，5，6小时后，目的蛋白的表达量;第八节 基因工程药物的分离纯化;;第14页/共36页;第15页/共36页;（三）初步分离 1.分离细胞器：离心，超离心 2.除核酸：酶法DNase,RNase；超声 3.除脂肪：丙酮，脂肪酶 （四）粗分蛋白 1.盐析：NaCl，(NH4)2SO4沉淀 2.有机溶剂抽提：甲醇，乙醇，丙酮 3.等电点沉淀：除去杂蛋白 4.热变性：除去杂蛋白 （五）除盐 1.超滤 2.凝胶过滤 3.冻干 ;4 层析一般步骤：;第18页/共36页; ;第20页/共36页;第21页/共36页;第22页/共36页;非蛋白质类杂质的去除： （1）DNA的去除：采用阴离子交换或疏水层析去除 （2）去热源：生产过程中要作到无菌，在低温下操作，最后产品要通过过滤灭菌。采用阴离子交换、疏水层析、或亲和层析可去除热源物质。 （3）病毒的去除：色谱分离或过滤能去除病毒。;第九节 基因工程药物的质量控制;四、目标产品的质量控制：鉴别、纯度、活性、安全性、一致性。;（2）氨基酸成分分析：蛋白质在酸性或碱性条件下水解后，用氨基酸分析仪进行组成分析。 注意：碱水解会引起精氨酸、胱氨酸及部分赖氨酸被破坏 ；酸水解条件下，色氨酸、酪氨酸易被??坏 。;②双向对角线SDS：既无链内又无链间二硫键的分子位于对角线上(两向电泳中分子迁移率相等) ;存在链内二硫键的分子位于对角线的上方(第一向泳动快,第二向泳动慢) ;而存在链间二硫键的分子由于第二向电泳时被还原,分子变成小的肽链而位于对角线的下方。;（7）重组蛋白结构分析;第29页/共36页;2.纯度分析;3.生物活性测定：需要通过动物体内试验和细胞培养进行体外测定。此外，需要测定重组蛋白的抗原性，防止其过强的免疫原性诱发体内产生免疫反应造成伤害。还有长期毒性实验。 体内测定：建立合适的动物模型 体外测定：细胞培养计数法、3H-T α R掺入法等。;1.液态保存 ①低温保存 ②在稳定pH下保存 ③高浓度保存：浓度高，蛋白质比较稳定。 ④加保护剂保存：多数蛋白质在疏水环境下稳定，可加入稳定剂如糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂；有些蛋白质在高离子强度下稳定，可加入中性盐；有些蛋白质易氧化，可加入一些还原剂。;第十节 基因工程药物的制造流程;质量控制标准和要求：;成品检定;感谢观看！