荷斯坦奶牛隐性遗传疾病检测技术的建立及应用.pptxVIP

荷斯坦奶牛隐性遗传疾病检测技术的建立及应用第1页/共22页第2页/共22页一、背景隐形遗传疾病： ? 有害基因传代 繁殖、生长及经济性状缺陷 ? 人工授精、胚胎移植等现代繁殖技术 扩大危害范围 ? 国内检测技术缺乏，国外费用昂贵 ? 很有必要建立一种准确、快速而且成本较低的遗传疾病鉴定方法? 对奶牛群进行检测? 淘汰有害基因?为健康的选育提供依据第3页/共22页致病分子机理：疾病DUMPSBLADCVM致病基因UMPSCD18(β亚基) 基因SLC35A3碱基突变C405-T405A383-G383Exon4:G-T氨基酸转换精氨酸-终止密码天门冬氨酸-甘氨酸缬氨酸-苯丙氨酸功能缺失不能催化乳清酸转为尿甘酸整合素表达明显减少或缺乏核苷酸糖转运酶不足酶切位点AvaⅠ酶切位点消失TaqⅠ酶切位点消失无第4页/共22页二、材料和方法材料 132份精液样本； 417头荷斯坦牛的血液样本方法 第5页/共22页提取DNA引物设计 退火温度摸索对所有样本进行疾病检测筛选出有害基因携带者AS-PCRCRS-PCRPCR-RFLP测序验证结果第6页/共22页Allele-specific PCR返回第7页/共22页Created Restriction Site PCR 根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计 PCR 引物， 其中一条引物根据突变位点邻近序列设计， 人为引入错配碱基， 使得引物3’端和单碱基突变的一种突变型在 PCR扩增后形成一个酶切位点， 其PCR 产物可用类似 PCR-RFLP方法进行分析。返回第8页/共22页三、结果建立AS-PCRCRS-PCR验证RFLP测序验证扩大样本检测及应用应用第9页/共22页1-4：健康个体（90bp）； 5：携带者（261bp/90bp）； M：Marker 1、DUMPS（尿苷酸合酶缺乏症）1.1 AS-PCR： 扩增条件：两引物分开扩 Tm：63.3℃第10页/共22页1.2 利用RFLP和测序技术验证：所建技术准确、可靠CC：健康个体；CT ：DUMPS携带者；M：MarkerIPCR扩增结果：目的片段为358bp DUMPS携带者测序结果 健康个体测序结果 第11页/共22页1.3 扩大样本检测549个：（417个奶牛样本和132个精液样本）基因型Genotype样本数Number基因型频率Genotype frequency等位基因频率Allele frequencyTCCT10．00180.00090.9991CC5480.9982合计5491.0第12页/共22页1-2健康个体818bp；3：携带者为818bp/500bp；M：Marker2、BLAD（白细胞黏附缺陷病） 2.1 AS-PCR：扩增条件：两引物分开扩 Tm：65℃第13页/共22页2.2 利用RFLP技术验证： 酶切结果：AA：健康个体；M：MarkerIPCR扩增结果：目的片段为961bp 第14页/共22页2.3 扩大样本检测：549个（417个奶牛样本和132个精液样本）无BLAD有害基因第15页/共22页3、CVM（脊椎畸形综合症）3.1 CRS-PCR:AA：健康个体；AB：CVM携带者；M：MarkerIPCR扩增结果：目的片段为225bp 第16页/共22页3.2 利用测序技术验证： 该方法准确、可靠CVM携带者测序结果 健康个体测序结果 第17页/共22页3.3 扩大样本检测：549个（417个奶牛样本和132个精液样本）基因型Genotype样本数Number基因型频率Genotype frequency等位基因频率Allele frequencyTGGT100.0290.0150.985GG3320.971合计（Total）3421.0第18页/共22页四、讨论减少了引物设计和条件摸索的难度，更稳定单管AS-PCR技术比较两步AS-PCR技术比较PCR-RFLP技术准确、快速、大规模应用难度减低快速低成本第19页/共22页三种隐形遗传疾病在公牛群携带情况表DUMPS美国198419902%0.2%-2.5%BLAD美国1992199914.1%9.6%波兰19951999200020032004-20067.9%4.0%2.1%1.8%0.8%德国199720079.4%0.3%CVM德国200220078.3%2.3% 表明分子标记辅助选择能够从根本上降低有害基因频率第20页/共22页致谢非常感谢导师张淑君教授感谢实验室各位老师感谢武汉市畜牧兽医研究所刘晓华老师感谢张老师小组的所有成员和实验室的 同学第21页/共22页感谢您的指教！第22页/共22页感谢观看！