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浅谈乙肝病毒检测;病毒鉴定方法;乙肝病毒检测; HBV抗原抗体系统检测临床意义;第5页/共26页;第6页/共26页;二、乙肝病毒核酸定量检测;PCR分四个阶段;如何定量?;定量原理;荧光化学;TaqMan;SYBR Green I 工作原理;2.所用试剂;3、实验步骤;4.PCR扩增
对各标本进行标记
反应条件:
93℃ 2分钟
93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环
93℃ 30秒→45℃ 60秒→30个循环
FAM通道检测HBV核酸,VIC通道检测内标
;4.结果判定
1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30,VIC检测通道扩增曲线有明显对数期,则为阴性或小于检测灵敏度
2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30
按以下方法判断:
C100,HBV DNA浓度100 IU/ml
100≤C ≤ 5.0E+008 ,HBV DNA浓度=C IU/ml
C5.0E+008 ,HBV DNA浓度5.0X108 IU/ml 如需精确定量结果,可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测,则样品HBV DNA浓度=(CX稀释倍数) IU/ml
;5.注意事项
1 每次实验需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品,满足要求方可进行判定(阳性质控品Ct30,阴性质控品无明显对数期或Ct值等于30 VIC检测通道扩增曲线有明显对数期)
2 本试剂盒的最低检出浓度为30IU/ml,最低定量浓度为100IU/ml
3 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作(带口罩手套),所有操作在生物安全柜内操作,物品不能随意带出生物安全柜,用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。
;一、乙肝病毒e抗原检测;第20页/共26页;2.所用试剂;3、实验步骤;5.加酶
每空加酶标抗体50 μL,混匀(空白对照不加)
6.温浴
37℃温浴25分钟,室温平衡5分钟(封口膜覆盖孔口,避免其他因素影响)
7.洗涤
洗涤液充分洗涤5次,洗涤完扣干(每次应保持30-60秒的浸泡时间)
8.显色
每孔加入A、B底物50 μL,混匀,37℃暗置15分钟
9.终止
每孔加50 μL终止液50 μL,混匀
10.测定
酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值,记录结果,30分钟内测定完成)
;4.结果判定
1. 临界值(C.O)计算
临界值=阴性对照孔OD值均值N X 2.1
注意:阴性对照孔均值N大于0.1应重新实验,小于0.05按0.05计算
2. 结果判定
样品OD值/ C.O ≥1为HbeAg阳性
样品OD值/ C.O 1为HbeAg阳性
3.阴性对照孔均值N大于0.1或阳性对照均值≤0.4实验无效,应重新实验;5.注意事项
1. 洗涤时各孔均加满,防止孔内有游离酶未洗净影响结果
2. 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作(带口罩手套),所有操作在生物安全柜内操作,物品不能随意带出生物安全柜,用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。
3.微孔板拆封后,取出当天用的微孔条后,其余用封口膜封存避免受潮
;感谢观看!
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