酶的提取和分离纯化.pptxVIP

酶的提取和分离纯化;本章主要内容;11. 酶的提取、分离纯化;11.1 酶的提取、纯化的基本原则;注意点;酶分离纯化的工艺流程设计;酶分离纯化的工艺流程设计;材料选择及其前处理;11.2 细胞破碎;11.2.1 机械破碎法;机械破碎法;11.2.2 物理破碎法;1.温度差破碎法;2.压力差破碎法;Manton-Gaulin homogeniser valve ;压力差破碎法;压力差破碎法;3.超声波破碎法;11.2.3 化学破碎法;（1）有机溶剂处理;（2）表面活性剂处理;11.2.4 酶学破碎法;2.自溶法;丙酮干粉的制备;11.3 酶的抽提（萃取、提取）;抽提剂;抽提剂的组成;11.4 浓缩与初步提纯;2.初步提纯;11.5 酶的分离纯化方法;酶的分离纯化方法;11.5.1 根据溶解度不同进行的纯化;一、盐析法;球蛋白溶解度-溶液离子强度关系;盐析;盐析;盐析;盐析;二、有机溶剂沉淀法;有机溶剂沉淀法;三、共沉淀法;共沉淀法 例子;四、选择性沉淀法;五、等电点沉淀法;第45页/共139页;等电点沉淀法;六、液－液分离法;双相水溶液分离法(aqueous two-phase separation);11.5.2 按分子大小进行的纯化;一、凝胶色谱;凝胶色谱;凝胶色谱;凝胶色谱;凝胶色谱;凝胶色谱;二、膜分离技术;膜分离技术;透析;三、离心;11.5.3 根据电学解离性质不同进行的纯化;一、吸附交换（色谱）;吸附色谱;吸附色谱;2. 羟基磷灰石吸附;3. 离子交换色谱;第66页/共139页;（一）离子交换剂的选择;（二）离子交换色谱主要操作过程;(三)离子交换色谱的基本原理;（四）离子交换色谱的适用范围;二、电泳分离法;纸电泳;（一）凝胶电泳 凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。由于凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，故具有很高的分辨率。 （二）等电聚焦 在电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚集于与其相当的等电点pH位置上，不再移动而达到分离的目的。 优点：高分辨率 缺点：不适用于在等电点不溶或发生变性的蛋白质。;聚丙烯酰胺凝胶(PAG);DISC电泳(Discontinous electrophoresis) ;（三）SDS- PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;一般电泳中，迁移率m∝q/f，q-颗粒电荷，f-摩擦系数。 SDS电泳中m仅与蛋白质（亚基）的分子量有关，㏒M=C-bm。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳因此可用于蛋白质分子量的测定。 ;SDS;SDS;SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;评介纯度Assess purity;三、聚焦色谱;第83页/共139页;聚焦色谱;聚焦色谱;2. 选择适宜的pH梯度范围;3. 交换剂的用量;5. 洗脱;聚焦效应;聚焦色谱过程;6. 多缓冲液和蛋白质组分的分离;7. 交换剂的再生与贮存;11.5.4 利用专一亲和作用进行的纯化;一、亲和色谱;（一）亲和色谱剂;亲和色谱剂;第97页/共139页;（二）吸附;（三）洗涤和洗脱;1. 装柱Loading affinity column.;2. 加样 ;3. 蛋白质与亲和色谱剂作用;4. 洗出没有结合的蛋白质; 5. 洗出结合松散的蛋白质; 6. 洗脱结合紧密的蛋白质，收集目的物;二、亲和电泳法;亲和电泳法;三、亲和洗提;11.5.5 高效液相色谱HPLC(略）;11.5.7 酶的结晶;11.6 酶的纯化步骤;二、酶纯度的检查;11.7 酶纯化步骤的定量评价;酶的单位（U）;二、比活力;三、酶的得率或回收率;几种酶的分离纯化;;;;11.8 酶的提纯标准及剂型;; Preparation of enzymes for sale;;;;Approaches to maintain enzyme activity;;;;Effect of ions on enzyme stabilisation ;;;;;;;;感谢观看!