第09章酶免疫技术.pptxVIP

第09章酶免疫技术第1页/共51页第2页/共51页第二节酶免疫技术的分类一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节　酶联免疫吸附试验一、基本原理二、方法类型及反应原理思考题小结第3页/共51页三大经典标记技术三大经典标记技术发光免疫技术酶免疫技术放射免疫技术第4页/共51页第一节 酶免疫技术的特点第5页/共51页原理及特点抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性主要试剂: 酶标记的抗体或抗原酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性第6页/共51页原理及特点特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 第7页/共51页一、酶和酶作用底物标记酶的要求： 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 第8页/共51页酶和酶作用底物常用酶糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要 辣根过氧化物酶（HRP） RZ值：403nm （辅基）　　　与275nm（主酶）OD值之比 ELISA中应用最为广泛的标记用酶 第9页/共51页酶和酶作用底物常用酶碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP 肠粘膜AP β–半乳糖苷酶（β-Gal） 用于均相酶免疫测定 第10页/共51页酶和酶作用底物常用底物HRP的底物 HRPDH2+H2O2→ → → D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种 第11页/共51页酶和酶作用底物常用底物四甲基联苯胺 TMBHRP的常见底物 邻苯二胺 OPD5-氨基水杨酸5-ASA 2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS第12页/共51页酶和酶作用底物　HRP的常见底物 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。第13页/共51页酶和酶作用底物常用底物经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）AP的底物 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ）β-Gal的底物 第14页/共51页二、酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate）酶标记物 通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物 第15页/共51页酶标记抗体或抗原制备方法要求抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。 第16页/共51页酶标记抗体或抗原技术方法简单、产率高，重复性好制备方法要求标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定 ，不形成聚合物第17页/共51页酶标记抗体或抗原过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原 制备方法戊二醛交联法第18页/共51页酶标记抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。 第19页/共51页酶标记抗体或抗原标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度 纯化及鉴定常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯第20页/共51页三、固相载体固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 第21页/共51页固相载体要求 结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济种类塑料制品 微颗粒膜载体 第22页/共51页包被与封闭包被coating将抗原或抗体结合于固相载体封闭blocking用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附第23页/共51页第二节　酶免疫技术分类 第24页/共51页酶免疫组化组织切片或其它标本中抗原的定位 酶免疫技术均 相酶免疫测定液体标本中抗原或抗体的定性和定量固相酶免疫测定非均相液相酶免疫测定第25页/共51页一、均相酶免疫测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测