生物工程下游技术非线性色谱原理.pptxVIP

生物工程下游技术非线性色谱原理第1页/共33页第2页/共33页2.制备HPLC概述—主要结构单元输液部:输液泵 shimadzu LC-6AD(适用于分析-半制备,再循环半制备)分离部:制备柱　内径20～50mm，柱长50cm。检测部:检测器 shimadzu SPD-M10Avp馏分部:馏分收集器 shimadzu FRC-10A第3页/共33页制备HPLC概述—柱容量色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大 进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。第4页/共33页制备HPLC概述—制备HPLC与 分析HPLＣ比较目的 填料流量流通池 联系 制备HPLC样品中特定成分的高纯度获取，大量、廉价的制备 20μ以上为佳 0.1-150ml/min 最大允许流速可为150mL/min在进行制备HPLC之前，常先进行分析HPLC实验，对分析方法进行优化、放大应用到制备HPLC中。 分析HPLC 定性分析：检测的灵敏度定量分析：分离度、再现性 3-5μ 0.001-9.999ml/min一般的分析池的最大允许流速仅为5 mL/min，或者10mL/min第5页/共33页3. 制备型液相色谱仪 制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。第6页/共33页固定相流定相VsCsVmCm对应塔板界面基本概念Cs=KCm线性色谱:流动相中的样品浓度(Cm)与固定相中的样品浓度(Cs)呈线性关系.非线性色谱:Cm与Cs不存在线性关系的色谱.分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性色谱第7页/共33页非线性色谱的特点样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化;峰形的不对称性:不是高斯正态分布;色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降.第8页/共33页非线性色谱理论基础研究对象：样品在固定相和流动相中的浓度处于非线性关系下，各种实验参数对色谱分离过程的影响，建立起柱参数、溶质性质及操作条件之间的定量关系。首先要了解Cs与Cm之间的函数关系，也即要研究吸附等温线及相应的吸附模型第9页/共33页吸附等温线：一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。分类：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形第10页/共33页Cs凹形凸形线形CmSig峰形tRtRm图8. 分布等温线类型及对色谱峰形和保留时间的影响 第11页/共33页它反映了溶质分子在固体表面达到饱和时生成了单分子吸附层，随着溶质浓度的增加，吸附等温线的曲率逐渐减小，最后为零即达到饱和态。通常出现于大多数小分子化合物“拖尾”第12页/共33页H型等温线是凸形等温线的特殊状态，它代表了一类很容易在固体表面吸附的物质，而且很容易达到饱和，这类吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙烯、聚苯乙烯第13页/共33页凹形吸附等温线是适用于在低浓度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，从而生成多分子吸附层的那些物质，所以这种吸附等温线的曲率随浓度的增加而增加。第14页/共33页S形等温线实际上是凸形与凹形两种等温线叠加的产物，它代表了被吸附的分子之间具有很强的作用力，能进一步吸附其他分子，而溶质分子与固相表面的作用力相对较弱，或者与表面覆盖率无关。第15页/共33页？问题：各种类型等温线代表的溶质在两相间具哪些分配特性？？问题：从吸附等温线能提供哪些非线性色谱性质的信息？第16页/共33页吸附等温线可以提供以下信息：预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状；为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件；反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。第17页/共33页吸附等温线的测定A、静态测量法q与C之间的关系（q：溶质在吸附剂上的浓度；C：溶液浓度）：q=ΔC.V/G（V为溶液体积，G为吸附剂量）优点：方便简单，不需要特殊的仪器缺点：测量缓慢，平衡时间长，平衡点不容易判断，数据不易测准，对比较昂贵的生物样品不合适。第18页/共33页B、动态法常用的有4种方法:前沿分析法(FA)特征点前沿分析(FACP)特征点洗脱(ECP)平台洗脱(EP)第19页/共33页非线性色谱基本理论（P146－147）吸附平衡热力学；吸附平衡动力学;色谱基本物料平衡方程。色谱基本物料平衡方程可以解释为何不同的吸附等温线会产生不同形状的非线性色谱峰第20页/共33页非线性色谱固定相非线性色谱中粗和细的颗粒都在使用，原则上细颗粒填料的柱效高，价格比