流式细胞术分析技术及应用.ppt

非特异性的先天免疫细胞 γδＴ细胞:占外周血T细胞的10％以下，非抗原依赖型免疫细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达CD3量较普通T细胞多 NK细胞：占外周血淋巴细胞8－25％，传染病和肿瘤病人数量偏低。NK细胞可以根据NKR的不同而分类，丙型肝炎的发生和预后可能与NK细胞的表型相关 树突状细胞（DC）：分布在淋巴组织和外周血，机体主要的抗原提呈细胞 Treg细胞：调节性T细胞，自身免疫性疾病的发生关系密切 血液学中的应用 1）白血病和淋巴瘤的免疫分型 2）微小残留（MRD）检测 3） CD34+造血干/祖细胞的检测 4）活化血小板及网织血小板的检测 5）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） 6）网织红细胞计数 2-4 color cytometer 10-20 color cytometer sorter – high-end res 1953，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形 1967，发展了一种液流束、照明光轴、检测系统三者垂直的流式细胞仪 1969 ， Van Dilla Fulwyler 发明第一台荧光检测细胞计 1975 ， Kohler 和Milstein 提出单克隆抗体技术 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的单个细胞/生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。 流式细胞仪的工作原理 液流系统 流动室 液流驱动系统 光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统 液流系统：流动室、液流驱动系统 流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作，是液流系统的心脏。 样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出； 鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从嘴射出。 进样孔 鞘液 激光束 荧光信号 FCM的液流系统（如何形成单个细胞流） 样本管 鞘液管 液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱 为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。 激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） 光学系统 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (PE) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL 流式细胞仪光路图 氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以633nm较强。 前向散射光信号 细胞大小  侧向散射光信号 细胞内颗粒  散射光信号 外周全血细胞散射光双参数点图 用荧光标记抗体 抗体特异性地结合细 胞上对应的抗原 表达该抗原的细胞被标记上荧光； 抗原表达多的细胞荧光强度强 阳性细胞百分比或浓度 靶蛋白浓度 荧光信号 FL1 – FITC FL2 – PE FL3 - PC7 荧光的产生 荧光素种类 FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm GFP (绿色荧光蛋白) ：绿色 PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 荧光产生过程 滤光片：Optical Filters 460 500 540 460 500 540 460 500 540 SP 500 LP 500 BP500/50 长通 短通 带通 光收集系统：光电倍增管（PMT） 荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管（PMT）检测。 细胞分选系统 激发光 + - 电极板 单细胞收集管 数据显示 荧光检测器