成信工环境工程微生物学实验指导03培养基的制备和灭菌技术.docVIP

PAGE 22 PAGE 21 PAGE 1 实验三 培养基的制备和灭菌技术 一、实验目的 （一）熟悉灭菌前的准备工作。 （二）掌握培养基和无菌水的制备方法。 （三）掌握高压蒸气灭菌技术。 二、实验仪器、材料 （一）培养皿（直径90 mm）10套，试管（15 mm×150 mm）5支，（18 mm×180mm）5支，移液管（10 mL）1支，（1 mL）2支，锥形瓶（250 mL）2个，烧杯（500 mL）1个，玻棒2支，玻璃珠30粒。 （二）纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）。 （三）精密pH试纸6.4～8.4、10％HCl、10％NaOH。 （四）牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、或市售营养琼脂培养基、蒸馏水。 （五）高压蒸气灭菌锅、烘箱、煤气灯或酒精灯。 三、实验内容 （一）玻璃器皿的洗涤和包装 1．洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。 2．包装 （1）移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成l～1.5 cm长的棉塞（以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹人管内）。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑人管内。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4～5 cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端（图7A)，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。按实验需要，可单支包装或多支包装，待灭菌。 （2）用棉塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住 棉塞的制作：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中心厚，周围逐渐变薄的圆形，对折后卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的口内，棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，以管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧贴管壁和瓶壁，不能有皱折，以防空气微生物沿棉塞皱折侵入。棉塞插入2／3，其余留在管口（或瓶口）外，便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后，用牛皮纸包并用细绳或橡皮筋捆扎好（图8B）放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。 （3）培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将10套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，5套、5套相对）包好。 （二）制备培养基的一般过程 图7 A. 移液管B．试管、锥形瓶c．培养皿 培养基是微生物的繁殖基地。通常根据微生物生长繁殖所需要的各种营养物配制而成。其中含水分、碳化合物、氮化合物、无机盐等，这些营养物可提供微生物碳源、能源、氮源等，组成细胞及调节代谢活动。按培养目的不同，或培养不同种类微生物可配成各种培养基。通常培养细菌是用肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，用豆芽汁培养霉菌，用麦芽汁培养酵母菌。 培养微生物除了满足它们各自营养物要求外，还要给予适宜的pH、渗透压和温度等。 根据研究目的的不同，可配制成固体、半固体和液体的培养基。固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中加入凝固剂使呈固态。通常加入15g/L～30g/L的琼脂为固体培养基；加入3g/L～5/L的琼脂为半固体培养基。有的细菌还需用明胶或硅胶。培养基的制备一般过程如下： 1．配制溶液 取一定容量的烧杯盛入定量蒸馏水，按培养基配方逐一称取各种成分，依次加入水中溶解。蛋白胨、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量。注意：在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅拌，避免琼脂糊底烧焦。 2.调节pH 用精密pH试纸测培养基的pH，按pH的要求用质量浓度100g/LNaOH或体积百分数10%HCl调整至所需的pH。 3．过滤 用纱布或滤纸或棉花过滤均可。如果培养基杂质很少或实验要求不高，可不过滤。 4．分装 按图8-9所示，将培养基分装于试管中或锥形瓶中（注意防止培养基玷污管口或瓶口，避免浸湿棉塞引起杂菌污染），装入试管的培养基量视试管的大小及需要而定，一般制斜面培养基时，每支试管装的量为试管高度的，1/4～1/3。 图8 培养基的分装 图9置放成斜面的试管 5．斜面培养基的制作 将已灭菌的装有琼脂培养基的试管取出，趁热斜置在木棒（或橡皮管）上，使试管内的培养基斜面长度为试管长度的1/3～1/2之间，待培养基凝固后即成斜面（如图10。 （三）本实验用培养基的制备 肉膏蛋白胨琼脂培养基（供测定细菌总数用及细菌纯种分离培养用）。 1．培养基配方 牛肉膏1.5g，蛋白胨3.0g，氯化钠1.5g，琼脂6g，蒸馏水300 mL，pH=7.6 灭菌：1.05 kg/cm2，20 min。 2．操作 （1）取一个500 mL的烧杯，装300 mL蒸馏水。 （2）在药物天平上依次称取配方中各成分，放入水中溶解，待琼脂完全融化后停止