成信工环境工程微生物学实验指导04土壤（水）中细菌的接种和培养技术.docVIP

PAGE 22 PAGE 21 PAGE 1 实验四 土壤（水）中细菌的接种和培养技术 一、实验目的 1、学习并掌握水样的采取方法； 2、掌握倒平板的方法； 3、掌握微生物的稀释涂平板接种技术； 4、掌握微生物的培养技术 二、实验原理 在土壤、活性污泥及生物膜等构筑物中，微生物都是以群体形式混杂在一起的，要了解其微生物间的相互关系、降解机理及优势类群，需要进行纯接种技术和培养技术。纯接种技术工作对污染控制也具有特别重要的意义。将从自然环境中分离到的有着特殊降解能力的高效菌种投放到处理系统中，可强化系统处理能力，提高其处理效果。 要想得到某微生物的纯种，通常是根据其对营养、温度、pH值、溶解氧等条件的要求选择不同的培养基（如培养霉菌用查氏培养基或马铃薯培养基；酵母菌用麦芽汁培养基；放线菌用高氏1号培养基；腐生细菌用牛肉琼脂培养基等），在一定的条件下进行培养，在用划线分离法或稀释分离法分离、纯化，直至得到纯菌体。 三、实验仪器、材料 （一）无菌培养皿（直径90 mm）10套、无菌移液管l mL 2支、10 mL l支。 （二）营养完全培养基1瓶、活性污泥或土壤或湖水1瓶、无菌稀释水90mL l瓶、9 mL的5管。 （三）接种环、酒精灯或煤气灯、恒温箱。 四、实验内容 1．取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水或土壤或活性污泥，迅速带回实验室。 2．稀释水样 将1瓶90 mL和5管9 mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。在无菌操作条件下，用10 mL的无菌移液管吸取10 mL水样 图16 样品稀释过程 （或其他样品10 g）置于第一瓶90 mL无菌水（内含玻璃珠）中，将移液管吹洗三次，用手摇10 min将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的菌液。用1 mL无 菌移液管吸取1 mL 10-1浓度的菌液于一管9 mL无菌 水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-6。稀释过程如图16。 3．平板的制作 取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个（三个平行样品），另1个为空气对照。取1支1mL无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内（注意：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀，吹吸时不能产生气泡）。加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板。 4.培养技术条件 将稀释涂布好的平板倒置，于恒温养箱中，30-35℃培养24~48 h，然后观察结果。（注：若在无菌室内操作，倒平板按图17操作）。 图17 倒平板 图18 接种环及其他器具 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖l0min后盖上皿盖，倒置于30℃培养24～48 h后观察结果。 五、几种接种技术操作 由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，现简介如下： （一）接种用具 常用的接种用具有接种环、接种针、接种钩、玻璃刮刀、铲、移液管、滴管等。接种环和接种针等总长约25 cm，环、针、钩的长为4.5 cm，可用铂、电炉丝或镍丝制成。上述材料以铂金丝最为理想，其优点是：在火焰上灼烧红得快，离火焰后冷得快，不易氧化且无毒。但价格昂贵，一般用电炉丝和镍丝。接种环的柄为金属的，其后端套上绝热材料套。柄也可用玻璃捧制作。 （二）接种环 微生物的分离培养、接种等操作需在经紫外线灯灭菌的无菌操作室、无菌操作箱或生物超净台等环境下进行。教学实验由于人多，无菌室小，无法一次容纳所有实验者。所以，在一般实验室内进行时要特别注意无菌操作。也可多组分批进行。 （三） 稀释平板涂布法 稀释平板涂布法与稀释平板法、平板划线法的作用一样，都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。此法接种量不宜太多，只能在0.5 mL以下，培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置。此法步骤如下： （1）稀释样品：方法与稀释平板法中的稀释方法和步骤一样。 （2）倒平板：将融化的并冷至45℃左右的培养基倒入菌培养皿中，冷凝后即成平板。 （3）用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀。 （4）正摆在所需温度的恒温箱内