基因工程制药课件.pptxVIP

基因工程制药 第一节 概述 自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。 1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近50种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。基因工程生产的活性蛋白与多肽（1）免疫性蛋白：各种抗原和单克隆抗体（2）细胞因子：INF、IL、CSF、EGF、凝 血因子（3）激素：胰岛素、生长激素、心钠素（4）酶类：尿激酶、链激酶、葡激酶、组 织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化 物歧化酶 基因工程技术生产药品的优点（1）生产以往难以获得的生理活性蛋白和多肽（2）提供足够数量的生理活性物质进行深入研究 和扩大应用（3）开发更多的内源性生理活性物质（4）改造内源性生理活性物质作为药物的不足（5）可获得新型化合物，扩大药物筛选来源第二节 基因工程药物生产的基本过程 基本原理 将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术——基因工程技术获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌或细胞培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装上 游下 游 上游阶段： 首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。 选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。上游阶段在实验室完成。 下游阶段： 将实验室成果产业化、商品化。主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度纯品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。（优化发酵工艺、提高和保证产品质量）第三节目的基因的获得应用基因工程生产药物，首先必须构建一个特定的目的基因无性繁殖系（即产生各种新药的、不同的基因工程菌株）。来源于真核细胞的目的基因不能直接分离得到，只能拷贝DNA的很小一部分（10-5-10-7）。真核基因一般都有内含子。原核细胞表达时缺乏mRNA转录后加工系统，mRNA不成熟，即不能直接克隆真核基因。克隆真核基因方法：逆转录法、化学合成法 真核基因克隆方法一、逆转录法——原理分离纯化目的基因——mRNA模板-1逆转录酶单链cDNAmRNA的互补DNA逆转录酶DNA-SI模板-2双链cDNA含表达信息逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 1、mRNA的纯化mRNA的特点：3’末端含有一多聚腺苷酸（polyA） 组成的末端，能吸附于寡聚脱氧腺苷酸（dT）纤维素柱上。方法：亲和层析法 2、cDNA第一链的合成一般 mRNA都带有3’－polyA，所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。用放射性探针法检测。 3、cDNA第二链的合成以cDNA第一链为模板合成第二链。 4、cDNA克隆用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法： （1）加同聚尾连接：在载体和cDNA的3’-末端加上互补的同型多聚酶序列。 （2）人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定（1）核酸探针杂交法（2）免疫反应鉴定法真核基因克隆方法 逆转录法——过程核酸探针杂交法免疫反应鉴定法目的cDNA克隆的分离鉴定mRNA的纯化dT-纤维素柱吸附 cDNA文库鉴定 cDNA第一链dNTP*质粒DNA(pUC/pBR322)噬菌体DNA(λgt10/λgt11) cDNA第二链cDNA克隆导入宿主细胞二、逆转录－聚合酶反应法 该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。三、化学合成法 1、化学合成法——前提条件知道目的基因的核苷酸排列顺序知道目的蛋白质的氨基酸顺序 2、化学合成法——不足不能合成太长的基因选择密码子困难费用高四、筛选基因的新方法编码序列富集法岛屿获救 PCR 法动物杂交法功能克隆法构建 cDNA 文库差异显示技术的应用编码序列富集法利用磁力对cDNA文库中的目的基