聚合酶链式反应体外扩增.pptxVIP

聚合酶链式反应体外扩增;聚合酶链式反应示意图;PCR仪;;1. 聚合酶链式反应;（1）DNA聚合酶;（2）寡核苷酸引物;（2）寡核苷酸引物;（2）寡核苷酸引物;（3） 脱氧核苷三磷酸;（4）二价阳离子;（5）维持pH值的缓冲液;（6）一价阳离子;（7）模板DNA;聚合酶链式反应的设计;3. 延伸：与DNA聚合酶的活性有关。一般Taq DNA聚合酶的最适温度为72-78℃，延伸时间由扩增产物的长度决定，一般1kb用1分钟来保证充足的时间。 4. 循环数：由反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。一般30-35个循环。 ;循环数主要取决于最初靶分子的浓度。 如： 3x105、 1.5x104、 1x103 25~30、 30~35、 35~40 过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数； 平台效应：PCR反应后期，扩增产物并不成指数方式的增加； 产生原因：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。;1. 按以下次序，在0.5ml无菌离心管加入： 10×PCR缓冲液 5μl 20mmol/L 4种dNTP混合液 1μl 20μmol/L 正向引物 2.5 μl 20μmol/L 反向引物 2.5 μl 1-5U/ μl 热稳定DNA聚合酶 1-2单位 模板 5-10μl 用ddH2O 补足到50 μl ;2. 设置反应、循环条件 预变性：94℃ 3-5min 变性 30-40 cycles 退火 延伸 延伸 72 ℃ 10min 保存 4 ℃;3. 结果检测 吸取5μl反应后的溶液，用琼脂糖凝胶电泳来检测扩增结果，用DNA marker来判断扩增片段的大小。 扩增条带与预期大小要一致。 可以用DNA序列分析，Southern杂交等方法鉴定。 ;PCR结果疑难问题分析;PCR结果疑难问题分析;PCR结果疑难问题分析;PCR结果疑难问题分析;PCR结果疑难问题分析;PCR结果疑难问题分析;PCR结果疑难问题分析;2. 制备克隆用PCR产物的纯化;制备克隆用PCR产物的纯化方法;制备克隆用PCR产物的纯化方法;3. 克隆化的PCR产物连入T载体;克隆化的PCR产物连入T载体的方法;克隆化的PCR产物连入T载体的方法;4. 通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点;通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点;通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点;通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点;通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点;11. 将转化的细胞涂布在含有抗生素、IPTG和X-gal的固体培养平板上。 12. 过夜培养后，挑取白色菌落，进行培养。 13. 提取质粒DNA。 14. 用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定，或用PCR进行鉴定。 15. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆DNA片段的大小。 16. 通过测序来分析PCR扩增片段的正确性。;5. 应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）;应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）;应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）;应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）;应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）;6.克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定;7.长距离PCR;如何解决标准PCR难以扩增长片段DNA的问题？;8.反向PCR;反向PCR示意图;9.实时定量PCR;实时定量PCR的应用范围;第52页/共64页;第53页/共64页;第54页/共64页;荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景