Ⅳ酶的提取与分离纯化.pptxVIP

Ⅳ酶的提取与分离纯化第1页/共40页 二 预处理1.加热：使温度达到最适温度2.凝聚，絮凝3.加酸碱：达到最适PH第2页/共40页 三 细胞过滤分离1.细胞破碎法⑴机械破碎法：研磨、搅拌、匀浆⑵物理破碎法：温度差法、压力差法、超声 波空穴效应⑶化学破碎法：酸碱，有机溶剂破坏细胞壁、膜⑷酶破碎法：加酶破坏细胞壁、膜；最适条件培 养，使溶酶体破裂自溶2.过滤方法：加压、常压、减压过滤法※空穴效应：超声波使发酵液中产生许多小气泡， 气泡破裂产生内爆力使细胞破碎第3页/共40页 四 酶提取1.本质：使胞内酶溶解到发酵液中，使酶出 细胞2.方法：盐溶法，有机溶剂溶解法，PH远离 PI3.条件：T：0oC-10oC PH：酶活力范围内，远离PI 提取液体积：酶液体积的2-5倍第4页/共40页 ※酶工程下游技术操作条件T：0-10oC低温PH：根据要求,远离或趋近PI加酶活保护剂：有机溶剂提取、沉淀分离时防酶失活第5页/共40页 五 酶的分离纯化沉淀分离膜分离离心分离层析分离电泳分离等电点分离第6页/共40页 ㈠沉淀分离一 盐析法1.原理:高浓度(NH4)2SO4中和蛋白质表面电 荷,使同电相斥作用减小凝聚沉淀2.第7页/共40页 二 等电点法沉淀分离1.原理:PH=PI时,带电量为零,同电相斥作用 最小,凝聚沉淀2.注意：等电点法不破坏水膜，不一定沉 淀，须与其他方法联合使用第8页/共40页 三 有机溶剂沉淀法1.原理:有机溶剂破坏蛋白质三级结构,使非 极性基团外露,极性基团内藏,使水膜 破坏,凝聚沉淀.第9页/共40页 ㈡膜分离法一 压差膜法1.纳滤：2.微滤：3.超滤：第10页/共40页 二 电位差膜法（电渗法）1.定义：用两块膜把水槽分为三个室，加空 间电场，使中间室中待分离液中正、 负离子分别电渗到两边的两室2.注意：正离子向靠近负极的室电渗 负离子向靠近正极的室电渗第11页/共40页 三 扩散膜法1.定义：将待分离液装入膜袋中，膜袋外为 浓度大于或小于待分离液的溶液。 利用浓度差使待分离液中水、杂质 通过渗透或渗析而与需要的组分分 离2.渗透与渗析⑴渗透：只有溶剂透过膜⑵渗析：有溶质透过膜第12页/共40页 四 膜的选择1.透水率：2.截留率：3.截留物相对分子量：第13页/共40页 ㈢离心分离一 离心机的选择1.常速离心机：Vmax≤8000r/min； 用于：2.高速离心机：Vmax≤（1-2.5）×104r/min； 用于：3.超速离心机：Vmax＝（2.5-12）×104r/min； 用于：生物大分子、第14页/共40页 二 离心方法1.差速离心法：利用密度（质量数）不同的 物质离心速度不同而分离 密度大的物质在离心瓶底部 ，密度小的在上部2.密度梯度离心法：第15页/共40页 3.等密度离心法：第16页/共40页 ㈣层析分离一 吸附层析1.原理：利用各物质在同种吸附剂中扩散速 度不同而分离2.常用吸附剂：第17页/共40页 二 分配层析1.原理：利用吸附剂与载体的共同作用，各 物质扩散速度不同而分离，比吸附 层析效果好2.三类：⑴滤纸层析 ⑵ ⑶第18页/共40页 三 离子交换层析1.原理：利用离子交换剂上柱，以离子键与待分离物结合，再水洗掉杂质，洗脱剂洗脱待分离物，从而得到待分离物，离子键结合稳，效果好2.几个重要的离子交换剂：3.几个重要的洗脱剂：※离子交换剂：阴离子交换剂：带正电的物质，可吸附阴离子阳离子交换剂：带负电的物质，可吸附阳离子第19页/共40页 ※层析基本操作过程层析柱的准备固定相材料的准备装柱平衡上样（洗涤和） 洗脱收集洗脱液洗脱液检测，绘制洗脱曲线（柱再生）第20页/共40页 四 凝胶层析1.原理：待分离液与凝胶溶液混合上柱，利 用大分子太大，不从凝胶网孔通过 ，而是从凝胶粒子间通过，受阻力 小，沉降快，而小分子小，可从凝 胶网孔通过，在凝胶中受阻力大， 沉降慢而分离分子大小差距大的物 质2.几种常用凝胶：第21页/共40页 五 亲和层析1.原理：固定相上柱成母体，再用母体活化剂为母 体引入活泼基团，使