细胞免疫学技术.ppt

细胞免疫学技术 * * 第一页，共三十二页，2022年，8月28日 细胞免疫学技术种类 细胞免疫学技术主要是对各种免疫细胞进行分离、鉴定、计数，并测定其功能。 细胞分离技术 免疫细胞表面标志和功能的检测 T细胞表面标志和功能的检测 B细胞表面标志和功能的检测 NK细胞活性的检测 吞噬细胞检测技术 * * 第二页，共三十二页，2022年，8月28日 第一节 免疫细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 二、细胞分离技术 三、分离标本的保存技术 * * 第三页，共三十二页，2022年，8月28日 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （一）血液标本的采取 无菌采血，抗凝 1、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法）采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简便、对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。 2、肝素抗凝法 肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，防止血液凝固。 3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法 EDTA为螯合剂，可与血液中钙离子结合而抗凝。 马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。 马、牛、 羊等大动物一般从颈静脉采血， 猪从颈静脉、 前腔静脉或耳静脉采血， 家禽由翼下静脉或心脏采血， 兔由心脏或耳 静脉采血， 犬由颈静脉或四肢静脉采血， 豚鼠由心脏采血， 小白鼠则可断尾或剪断 腋下血管或剪断眼球采血。 * * 第四页，共三十二页，2022年，8月28日 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （二）胸腺细胞悬液的制备 【方法】 4周龄健康小鼠，体重14~16g。 （1）小鼠颈椎脱臼处死。 （2）迅速取出胸腺。置于100目钢网上。注意无菌，洗干净胸腺上的血管。 （3）轻轻研磨，制成细胞悬液。 （4）用台盼蓝染色，计数。活细胞数＞90%。 看视频 * * 第五页，共三十二页，2022年，8月28日 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （三）巨噬细胞的采取 1、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法） 2、小鼠腹腔巨噬细胞的制备 【方法】20-25g小白鼠 （1）小鼠颈椎脱臼处死 （2）腹部消毒，无菌注入肝素-Hanks液 （3）吸出腹腔液，洗涤，计数，调整细胞浓度 * * 第六页，共三十二页，2022年，8月28日 第一节 细胞的分离技术 二、细胞分离技术 （一）外周血白细胞的分离 根据人外周血红细胞与白细胞的比重不同，其沉降速度随之而异。 1、自然沉降法 利用RBC自然沉降率较快的分离法。 抗凝血于室温或37℃静置30~60分钟，血液即分成明显的3层： 上层为淡黄色血浆， 紧贴红细胞上面的灰白层为白细胞 底层为红细胞 本法所得的白细胞损伤极轻微。 * * 第七页，共三十二页，2022年，8月28日 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （一）外周血白细胞的分离 2、加速红细胞沉降法 利用高分子量的聚合物（明胶）使红细胞凝聚成串钱状，借以加速红细胞沉降，使之快速与白细胞分离。 上层富含白细胞 红细胞凝聚成串钱状沉积在底层， 本法的细胞得率比自然沉降法高，但明胶增加白细胞粘性，对实验有所影响。 * * 第八页，共三十二页，2022年，8月28日 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （二）外周血单个核细胞的分离 （PBMC） [基本原理] 根据人类各种血细胞的比重有所不同，利用一种比重介于1.075~1.092之间而接近等渗的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而得以分离各种血细胞群。 表7 人外周血细胞密度一览表 ————————————————— 细胞 密度（kg/m3） ————————————————— 红细胞 ＞1.092 粒细胞 1.070~1.090 淋巴细胞和单核细胞 1.060~1.075 血小板 1.