外源基因的原核表达.pptxVIP

外源基因的原核表达第1页/共118页 28 五月 20232外源基因的原核表达第2页/共118页 28 五月 20233外源基因表达的作用：外源基因表达泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。外源基因的表达是研究和探索基因功能、基因表达调控机制、编码蛋白质的结构与功能的重要方法，也是制备和生产新型蛋白质药物、诊断试剂必不可少的手段。通过外源基因的表达可由宿主细胞产生大量的目的蛋白。第3页/共118页 28 五月 20234常用的原核外源表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统蓝藻表达系统第4页/共118页 28 五月 20235原核生物基因表达系统的特点：1、原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。2、基因组结构简单，便于基因操作和分析。3、多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。第5页/共118页 28 五月 20236原核生物基因表达系统的特点：4、不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。5、内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。由于以上特点，近年来真核生物表达系统发展很快，并构建了相应的基因表达载体。第6页/共118页 28 五月 20237大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最为广泛的经典表达系统。属革兰氏阴性细菌。其特点是：遗传背景清楚目的基因表达水平高培养时间短第7页/共118页 28 五月 20238大肠杆菌表达系统的主要不足1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程。2、表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复杂。第8页/共118页 28 五月 20239大肠杆菌基因表达载体理想的大肠杆菌表达载体的特征1、稳定的遗传和复制能力，在无选择压力下保存于大肠杆菌细胞内2、具有显性的转化筛选标记3、转录可以调控，抑制时本底转录水平较低4、转录的mRNA能够在适当的位置终止且转录不影响载体的复制5、具备适用于外源基因插入酶切位点第9页/共118页 28 五月 202310大肠杆菌基因表达载体构成1、复制子：是一段包含起始位点和反式因子作用区在内的DNA片段。其功能是通过复制使载体稳定存在于大肠杆菌细胞。第10页/共118页 28 五月 202311大肠杆菌基因表达载体2、筛选标记：大肠杆菌经过转化后，仅有少数细菌能获得携带外源基因的质粒并稳定地传代，筛选标记可有效地筛选出转化有外源基因的阳性重组。第11页/共118页 28 五月 202312大肠杆菌基因表达载体3、启动子：是与DNA依赖的RNA聚合酶相结合的一段DNA序列。启动子是调控外源基因转录的重要顺式作用元件，与mRNA的合成有很大关系，是表达载体不可缺少的元件。第12页/共118页 28 五月 202313大肠杆菌基因表达载体4、终止子：在转录过程中能在特异位点将转录终止的DNA序列。有两种类型1、ρ－因子型终止子2、转录产物二级结构第13页/共118页 28 五月 202314第14页/共118页 28 五月 202315大肠杆菌基因表达载体4、终止子： 能在特异位点终止转录的DNA序列。终止子有两种类型1、ρ－因子2、转录产物二级结构第15页/共118页 28 五月 202316第16页/共118页 28 五月 202317第17页/共118页 28 五月 202318终止子的功能（1）、能能有效控制目的基因mRNA的长度（2）、提高mRNA的稳定性（3）、避免载体上其他基因的异常表达第18页/共118页 28 五月 202319大肠杆菌基因表达载体5、核糖体结合位点：原核细胞mRNA蛋白合成起始点上游的一段非编码序列。能与30S小亚基中16S rRNA3’末端的一段序列特异结合。此序列富含嘌呤，核心序列为SD序列。第19页/共118页 28 五月 202320大肠杆菌基因表达载体6、密码子：密码子有简并性，多个密码子为一个氨基酸进行编码，不同生物在利用这些密码子时其利用频率不同，不同的密码子会影响到大肠杆菌的翻译速度。第20页/共118页 28 五月 202321基因表达的机制基因工程技术的核心是基因表达技术。迄今为止，已构件建了不同类型的表达系统，可根据需要合理地选择适当的表达系统。外源基因在受体细胞中的表达包括：1、转录2、翻译两个环节第21页/共118页 28 五月 202322基因表达的机制基因工程的核心问题：有效表达外源基因表达的关键步骤：起始转录基因表达的限速步骤：转录起始的速率构建表达系统时首先要考虑的问题是：1、选择可调控的启动子2、相关的调控序列第22页/共118页 28 五月 202323目的：