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天津大学生物化学修改第1页/共34页 第三节 蛋白质的理化性质一、蛋白质的分子量 二、两性游离和等电点 三、蛋白质的胶体性质 四、蛋白质的沉淀反应 五、蛋白质的变性和复性 六、蛋白质的颜色反应 第2页/共34页 一、蛋白质的分子量蛋白质的分子量一般在1万—100万道尔顿由于是生物大分子，因此在溶液中极不稳定，不能用测定小分子物质的方法（如冰点降低、沸点升高）来测定一般以渗透压法、凝胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶电泳及超离心法来测定其分子量。超离心法较准确，但实验条件要求很高第3页/共34页 二、两性游离和等电点1+OH－+H++OH－+H+COOHPrH3N+COO－PrH3N+COO－PrH2NpH ＜ pI 4 ＜7pH = pI 7 =7pH ＞ pI 9 ＞ 7 由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有 第4页/共34页 二、两性游离和等电点2肽与氨基酸都有 α－COOH，α－ NH2，但肽还含有侧链R基上的可解离基团，且其为主要解离基团。肽链中的α－COOH与α－NH2相距较远，因此它们之间的静电引力较弱，可离子化程度较低。大的肽比小肽的离子化程度低，即大肽完全质子化所需pH比小肽低。N端α－NH2的pK，值比游离氨基酸的小，C－端的α－COOH的pK，值比游离氨基酸的大，侧链R基的pK，值在两者之间。 蛋白质两性游离的特点第5页/共34页 二、两性游离和等电点3在同一pH溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的性质和数量以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，可以利用这种性质来分离和分析蛋白质，称为蛋白质电泳分析法。常用的有纸上电泳、醋酸纤维膜电泳、聚丙烯纤维的凝胶电泳蛋白质两性游离的应用1第6页/共34页 二、两性游离和等电点3蛋白质两性游离的应用2电泳第7页/共34页 三、蛋白质的胶体性质1 由于蛋白质分子大，且球状蛋白质分子中亲水的氨基酸残基多位于颗粒表面，故在水溶液中能与水起水合作用。因此，蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质为什么蛋白质具有胶体性质第8页/共34页 三、蛋白质的胶体性质2蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有二个稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外力条件作用，不致互相凝集。如除掉这两个稳定因素，蛋白质便容易凝集析出。因此，可用此原理提取蛋白质，如常用中性盐硫酸胺来竞争水而使水化膜破裂，产生沉淀。蛋白质胶体稳定的原因第9页/共34页 三、蛋白质的胶体性质3蛋白质具有许多高分子溶液的性质。如扩散、粘度大、不能透过半透膜。利用不能透过半透膜的性质可以将蛋白质和其他一些小分子分开，常用方法有渗析和超滤。第10页/共34页 三、蛋白质的胶体性质4渗析血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液血液加压第11页/共34页 三、蛋白质的胶体性质4超滤第12页/共34页 四、蛋白质的沉淀反应1(概述)定义:使蛋白质从溶液中析出的现象。原理:蛋白质稳定因素有水化层和带电层,水化层是蛋白质分子表面的许多亲水基团与水分子结合形成的一层水膜，它使蛋白质颗粒不能相互接触聚集成大颗粒；带电层是蛋白质分子表面的可解离基团在一定pH环境下解离产生的。由于带同性电荷的蛋白质颗粒相互排斥，也使蛋白质颗粒不能聚集，当改变这些稳定因素，蛋白质分子相聚集而从溶液中析出。 特点:一般沉淀出的蛋白质是变性的。如果控制实验条件（如低温、温和沉淀剂），便可得到不变性的蛋白质。第13页/共34页 四、蛋白质的沉淀反应2(方式1)定义:加入大量中性盐(硫酸胺)以破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质从水溶液沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质的等电点(溶解度最小，易沉淀)则效果最好。各种蛋白质分子的颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此，调节混合蛋白质的溶液中的中性盐的浓度，可使各种蛋白质分段沉淀。 1．盐析1第14页/共34页 四、蛋白质的沉淀反应2(方式1)1．盐析2蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，它们被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀第15页/共34页 四、蛋白质的沉淀反应2(方式2)pH稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。通常这种沉淀为变性的，如控制温度（低温）并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不变性的蛋白质。 2．重金属盐沉淀蛋白质第16页/共34页 四、蛋白质的沉淀反应2(方式3)某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。沉淀条件应当是pH小于等于电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。3．生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质第17页/共34页 四、蛋白质的沉淀反应2(方式4)可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋