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基因重组和基因工程药事情第1页/共41页 第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature第2页/共41页 第二节 重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 第3页/共41页 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体基本原理 重组DNA技术与医学的关系本节主要内容：第4页/共41页 一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一） DNA克隆第5页/共41页 技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　第6页/共41页 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆第7页/共41页 目的：① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。第8页/共41页 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶第9页/共41页 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HⅠ定义：第10页/共41页 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类：作用：第11页/共41页 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：Hin dⅢ 属 种 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第12页/共41页 （三）目的基因(target gene) 感兴趣的基因 第13页/共41页 （四）基因载体 定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA载体的主要选择标准：能自主复制第14页/共41页 质粒 (plasmid)特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 第15页/共41页 第16页/共41页 二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达 第17页/共41页 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程第18页/共41页 （一）目的基因的获取化学合成法，从组织中提取等。（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 （三）外源基因与载体的连接第19页/共41页 目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15oC重组体载体自连目的基因 自连第20页/共41页 受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent) 导入方式：转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection)（四）重组DNA导入受体菌第21页/共41页 抗药性标记选择，免疫化学方法等。（五）重组体的筛选第22页/共41页 (插入失活法) 抗药性标记选择第23页/共41页 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体细胞筛筛选重组体 第24页/共41页 重组DNA技术操作的主