病理学常用研究方法研究生课程.pptxVIP

病理学常用研究方法研究生课程;整体水平：;蛋白水平：;一、免疫组化标准化问题探讨;(一)方法的选择;S-P法的优点 ① 方法统一 ② 有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒 ③ 一般2-3小时(30’-60’)，而ABC法需1天，分 子量小(60KD)，穿透力强 ④ 灵敏性高，特异性强，4个亚基都能于二抗上的生 物素结合，而且结合键强 ⑤ 背景低，非特异性反应少，等电点为6.5，接近于 中性，不与内源性凝集素样物质结合,而ABC法为10;S-P法与ABC法的区别;;(二) 固定、包埋;包埋：起初免疫组化对蜡温的要求很严，温度一高会严重影响结果。现在由于抗体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世，多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切成大片，容易脱片。因此，要控制蜡温在65℃以下;(三) 抗原修复(抗原暴露、抗原复原);抗原修复的目的： 就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：;热修复： 0.01M柠檬酸缓冲液，PH=6.0，95℃，10分钟 注意：脱片多——多聚L赖氨酸 干片 选医用微波炉 酶消化：1.细胞内抗原——0.1%胰蛋白酶 20’37℃ 2.间质抗原——4%胃蛋白酶37℃，4-8小时;(八)免疫组织化学的发展;2. 原位免疫PCR 在组织切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2→卵白素→洗净→生物素标记的DNA片断→洗净→原位PCR扩增→洗净→ACB或S-P显色 特点：①提高阳性率 ②定位好;2. 扩增：;3. Agarose 2-5%，用1×TBE电泳 ①扩增后液 5μl + 1μl loading buffer ②溴化乙淀染色 20’，UV照射下确认泳带→照相;三、Western Blotting;2. 蛋白定量 标准蛋白浓度制备：BSA，0，0.5，1，2mg/ml 比色：测定系数 换算成含量 → 计算出每个样品加样量 3. 电泳 丙烯酰胺 上部胶、下部胶 marker样品 4. 转膜 5. 洗膜 → 一抗、二抗 → 显色或自显影;四、组织芯片(Tissue Micro-Array, TMA);应用 免疫组化 DNA或RNA原位杂交 FISH 原位PCR;制作过程;感谢您的欣赏