电泳分析法金叶.pptxVIP

电泳分析法金叶; 1807-1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。; 1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定。 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖。;;一、定义及原理;以生物大分子为例阐明电荷来源;二、电泳分类 ; 1、自由界面电泳 2、区带电泳 3、高效毛细管电泳;自由界面电泳 ：在没有惰性支持物的液体接界面上进行的电泳。;区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动的电泳方法。 避免对流的干扰。;DNA序列分析电泳槽;中型双垂直电泳槽;实验室常见的电泳装置;1、区带电泳基本理论;当电泳达到稳态时，电动力等于介质的阻力，即F=F’。因此，我们得到 v/E表示迁移率，也称淌度，以U表示 带电粒子的电泳淌度在一定条件下取决于粒子本身的性质，即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。;电泳淌度;影响电泳迁移率的因素(必考)： 1、影响电泳迁移率的外界因素： 电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 电渗现象 溶液的温度和黏度 分子筛效应 2.影响电泳迁移率的内在因素： 质点所带净电荷的量 质点的大小和形状;指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。 ;醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜（cellulose acetate membrane，简称CAM）。 ;优点： 精确性高。 快速省时。一般电泳45-60min即可。 　　 灵敏度高，样品用量少。 　　 应用面广。如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋 酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 有利??扫描定量及长期保存。 　　 缺点： 分离效果不太好。;醋酸纤维素薄膜电泳示意图;（1）预处理 膜的准备：根据分离样品的多少将醋酸纤维薄膜裁切成合适的大小，在膜片无光泽的一面上用铅笔轻轻划一条加样线。加样线可选在距膜片一端2～3cm处，有时也可选在膜片的中央线附近。 膜片浸透：在一浅碟或培养皿中倒入所选择的缓冲液，将膜片小心地浮铺在缓冲液面上，将膜片的的无光泽面朝下。膜片的底面吸收电极缓冲液后逐渐下沉，直至电极缓冲液将膜片完全浸透。 膜片在电极缓冲液完全浸透后，用钝头镊子取出，稍稍用滤纸吸去多余的缓冲液，然后将膜片夹在两层滤纸之间吸干多余的缓冲液，但不能吸得过干而出现不透明的白色部分。; 用铅笔在薄膜无光泽面一端2cm处画一细线，加样时平稳地前后或左右来回移动加样器，于细线处加样。 毛细管、微量吸管、微量注射器或印模都可以用来加样。 线型加样 醋酸纤维膜上的样品线条宽度不应超过4 mm，样品线与膜片上边边缘之间的距离一般为3~5 mm。 样品的加样量或加样体积随样品的浓度、染色和检测方法等条件的不同而有较大的变化。; （3）电泳 电泳前，先用钝头镊子将加过样的膜片安放在电泳槽的支架上，膜片两端约0.5~1.0 cm的部分应与支架的顶面紧贴，膜面尽可能不与手指直接接触，以免膜面受到污染。如果在同一电泳槽内同时安放几张膜片，应避免相邻膜片之间彼此接触。 在电泳槽的两个电极室内注入适量的电极缓冲液，用3 ~ 4层滤纸作盐桥。膜片的两端分别用滤纸盐桥盖住，以此将膜片拉平固定并使电流通过。盖上电泳槽盖，让膜片在电泳槽内水平静置平衡10分钟，然后将电泳槽的两个电极与直流电源的正负极分别相接。;染色剂要求：不应溶解醋酸纤维薄膜 一般蛋白质的染色方法 氨基黑10B染色：酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。 丽春红S方法：是一种水溶性的阴离子重氮染料，带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合，显示红色蛋白条带。用3%三氯醋酸配制0.2%丽春红S溶液，将干燥的膜片浸入此染色剂中。染色时间不需要严格控制，但一般染色10分钟比较合适。;（5）漂洗/脱色 将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无色。 （6）干燥和透明 干燥：避免膜片发生卷