单细胞水平同位素拉曼散射分析.pptxVIP

单细胞水平同位素拉曼散射分析; 单细胞同位素拉曼散射是一种非破坏性的，非细胞培养的，集共聚焦显微、拉曼非弹性散射及其与同位素标记探针技术结合为一体的分析技术。共聚焦显微可以实现分析对象在细胞或亚细胞尺度上的测度，而拉曼非弹性散可以贯穿细胞，包含有几乎所有细胞储藏大分子指纹的信息，加之水介质的拉曼背景信号小，可实现对细胞的整体分析，若同时采用同位素探针技术，可以将功能过程示踪与生物系统发育信息相联系，进行功能与分类的耦合分析，以及元素生态循环和细胞代谢等系统生物学研究。; 1.激光共聚焦显微成像技术 以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源， 经过透镜、分光镜形成平行光后，再由物透镜聚焦在样品上，对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描，样品激发的光信号，通过分光镜分光，再经像透镜聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏所阻挡，因而不能不能被检测。这种双共轭成像方式称为共聚焦。;基本原理;技术指标;; 谱线特征 1）与入射光的频率无关，而由散射物质分子的振（转）能级所决定，因此有些谱线是与红外吸收谱线相一致。 2）在以波数为变量的拉曼光谱图上，斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布在瑞利散射线两侧，上述两种情况下分别相应于得到或失去了一个分子声子的振动能量。 3）一般情况下，斯托克斯线比反斯托克斯线的强度大，因为依据Boltzmann分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。 ; 分析特征 1）利用待测样品分子的特征拉曼谱线作为检测或灰度对比度成像，无需引入外源标记物（同位素由底物引入，认为是内原的），因此是非侵入式的测量； 2）水的拉曼背景信号较小，因此可在水环境下测量； 3）一般采用近红外光激发，对细胞组织的光损伤较小，能够穿透较厚的生物样品，有利于长时间采集样本和进行样品内部测量； 4）不利因素是自发斯托克斯的信号较弱，只有106-108个光子，影响探测灵敏度的提高。;测量装置; 增强??曼光谱 自发拉曼光谱的主要不足是信号太弱，若一味提高激发光的强度，可能会损伤细胞，同时采样时间太长也不利于动态过程的测定，目前提高信噪比的两种基本办法是：表面增强拉曼散射和相干反斯托克斯光谱两种分析策略。;; 2）共振反斯托克斯拉曼光谱 该过程是一种三阶非线性光学过程，通常采用两束中心频率不同的激光脉冲，分别作为抽运光（?L）和斯托克斯光（?S）来激发样品分子，当两束激光的频率差与分子某一振动模式的固有振动频率一致时（?R=?L-?S）， 分子的固有振动模式得到共振增强，并在第三束探测光（?P）的作用下产生反斯托克斯信号（?AS）， 其能级图如图所示，分为两步，第一步，抽运光和斯托克斯光脉冲同时到达样品使分子共振激发，在湮没一个抽运光光子的同时产生一个斯托克斯光子和一个相干声子；第二步, 产生的相干声子随后与探测光光子作用, 反射反斯托克斯光子。 ; 共振反斯托克斯拉曼光谱显著地提高了信号强度，同时由于信号相对蓝移，可以很好的与激发光分开，而过程存在的固有非共振背景噪声，可以利于两者的偏振状态、退相时间，以及空间域的差异进行相应抑制。; 3.同位素探针-拉曼光谱 同位素探针是指通过底物完成对生物标志物的标记，带有重同位素的生物标志物，其拉曼特征谱线因同位效应将发生红移动，采用光谱对比分析很容易鉴别出来，进而确定标志物，并与系统生物功能成分相联系，甚至由标记结合率确定新合成生物的比例及其动态过程。 理论解释 拉曼谱是入射光与分子相互作用，诱导其共价键的电子云形变产生极化场，进而相干叠加而形成散射光，散射光频率相对于入射光丢失和增加一个相应分子键的振动频率。按照经典的分子键的谐振子模型， ; 分子键的振动频率可以表示为 此处，c为光速(ms-1),k为双原子键的作用常数（Nm-1）,?是体系的约化质量， ?=m1m2/(m1+m2),可见振动频率反比于约化质量的平方根，当原子被其重同位素原子取代后，约化质量增加，而振动频率减小，因此特征谱线发生红移，以C-H键的氘代为例，C-D的频率相对变化为0.73，漂移带的相对强度则与重同位素的结合率成正比，依此可以计算底物的结合率。 ;Shifts of bands in SCRS caused by incorporation of different stable isotopes, Fully 13C-labeled E. coli (red) and unlabeled E. coli (blue). Available onli