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分子克隆总资料;;第二章 分子克隆单元操作;基因工程课程内容;2.1 用于基因克隆的载体;一、载体的基本概念;2、载体应具备的条件;3、载体类型;3、载体类型;3、载体类型;二、质粒(plasmid);（一）质粒的生物学特性;1、质粒的自主复制性;质粒的复制调控：调控区紧邻ori，方便构建 调控区编码RNAI（反义）和Rop蛋白，抑制复制引物RNAII与模板结合;调控区编码抑制蛋白Cop，控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合;根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：;2、质粒的不相容性;质粒的不相容性的分子机制;3、质粒的可转移性;4、携带特殊的遗传标记;天然质粒的改造;选择性标记：供重组子筛选用的遗传标记基因 ;质粒载体的特点：;（二）质粒载体的类型;（三）重要的大肠杆菌质粒载体;2、pUC18 / 19：最优秀的常规克隆载体 ;;第28页/共251页;3、T载体：克隆PCR产物用;4、pGEM：;（四）质粒DNA的制备与鉴定;氯化铯密度梯度离心法： 对质粒的构象要求较高时采用;碱裂解法： 最常用;沸水浴法： ;二、噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;l 噬菌体的基因组结构;l 噬菌体的感染周期;;l 噬菌体的溶原状态;2、l-DNA载体的构建： 1）缩短长度：按有效包装范围确定;插入型l-DNA载体：载量为0-14KB;取代型l-DNA载体：载量为10-25kb;2）删除重复的酶切位点，引入多克隆位点;3）加装选择标记;加装选择标记： imm434;加装选择标记：lacZ;4）构建琥珀密码子的突变体（环保的需要） ;3、l-DNA载体的主要类型：;4、l-DNA重组分子的体外包装：;5、l-DNA及其重组分子的分离纯化：;6、l-DNA作为载体的优点：;（二）大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA;M13噬菌体的感染周期;2、M13 DNA载体的构建;3、M13 DNA载体的特点：;（三）病毒载体;动物病毒载体 ;考斯质粒（cosmid）;考斯质粒载体的特点：;噬菌粒（phagemid or phasmid）;重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119;重要的噬菌粒载体：pBluescript （体外转录载体）;四、人工染色体载体;酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC）;酵母人工染色体的使用：;细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）;细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） ;2.1 用于基因克隆的载体;第二章 分子克???单元操作;基因工程的操作过程;2.2 DNA的体外重组（切、接）;1、限制性核酸内切酶的功能与类型;限制性核酸内切酶的类型;II型限制性核酸内切酶;II 型“限切酶”的识别与切割序列;2、II型“限切酶”的命名;II型限制性核酸内切酶的命名;3、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰;5‘粘性末端 3‘粘性末端 平端;EcoRI等产生的5‘粘性末端：;PstI等产生的3‘粘性末端;PvuII等产生的平头末端;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶 HindIII – HsuI: A / AGCTT 同尾酶：识别位点不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同 的末端序列 BglII：A / GATCT BamHI: G / GATCC 同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。;6、“限切酶”酶活性定义;7、限切酶的“星活性” （Star activity）;2.2 DNA的体外重组（切、接）;二、 T4 DNA连接酶;B. 修复RNA-DNA杂合分子中DNA链上缺口处 的磷酸二酯键;DNA连接酶的基本性质;DNA连接酶的活性单位定义;2.2 DNA的体外重组（切、接）;1. DNA聚合酶;5‘→3‘的核酸外切酶活性;缺口前移标记法;缺口前移标记原理;2）大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）;大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）;Klenow酶的基本用途之一： 补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端;Klenow酶的基本用途之二： DNA片段的同位素末端标记;3）T4-DNA聚合酶;T4-DNA聚合酶用途之一：; DNA片段的同位素末端标记;4）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）;反转录酶的基本