实验聚丙烯酰胺.pptxVIP

实验聚丙烯酰胺; 实验 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白;实验目的;实验原理;聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应：;三大效应; 1. 浓缩效应 ;;;;2.分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 3.电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。 ;实验仪器; 毛细滴管 刻度吸量管 玻璃管和橡胶帽 微量移液器 注射器和长针头 脱色摇床 ;试剂;贮存液;1准备 每人取电泳管1支，并在距电泳管下端7cm和7.5cm处画横线做标记，加1-2滴40％蔗糖于橡胶帽内堵住电泳管底部，塞紧。 ;试剂; 按上述操作混匀分离胶溶液，缓慢注入玻璃管7cm处，滴加一滴蒸馏水，然后在室温下聚合，聚合20-30min； 待分离胶成胶后，用滤纸条吸干上层水分，灌浓缩胶至7.5cm处，再滴加蒸馏水一滴，静置15min左右。 浓缩胶凝胶后，吸取上层水，拔掉橡胶帽吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气使用。;4样品液制备： 血清:0.1ml 40%蔗糖:0.1ml 0.05%溴酚兰:0.1ml 添加于一个小试管中混匀备用 ;5装电泳管和上样 将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡,然后在上层添加缓冲溶液覆盖凝胶管上端，除气泡。 加样品液10μl至浓缩胶面。 6电泳 上槽——负极（黑） 下槽——正极（红） 电流：先浓缩胶:1.5mA/管 然后分离胶:3.0mA/管 ; 7剥胶 电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。;第22页/共28页;实验结果;1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。 2．制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。 3．注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。 4. 氨基黑染色﹑脱色﹑染液回收。 5．固体胶切忌倒入水池。 6. 注意观察实验现象：分界面，浓缩效应 7.水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。 8.凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 9.剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 ;方法学评价;单体纯度高，在相同的实验条件下，电泳结果有很好的重复性。 凝胶杂质少，在很多溶剂中不溶，可适用于少量样品的制备，不致污染样品。 缺点：但它的操作较复杂,影响实验效果的因素较多,使其在生化实验教学中的开展受到一定限制。 ;醋酸纤维薄膜电泳;感谢您的欣赏