蛋白质高级结构性质及分离纯化.pptxVIP

蛋白质高级结构性质及分离纯化;X射线衍射法;第3页/共121页;核磁共振（NMR）;核磁共振基本原理;核磁共振原理半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当加一外磁场，这些原子核的能级将分裂，既塞曼效应。;共振条件：? = ?0 = ??0 实现核磁共振的两种方法;第8页/共121页;核磁共振新技术 ; NMR成像技术;蛋白质分子中的非共价键：;（3）盐键：;次级键的特点与作用;维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键 ;氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 盐键数量小 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定;酰胺平面与二面角;第17页/共121页;蛋白质的二级结构;（1） α- 螺旋(α-helix) ;①多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm.;; ③蛋白质分子大多为右手?-螺旋。 ④亲水基团位于螺旋的外侧，疏水基团位于螺旋的 内侧。;影响α- 螺旋稳定的因素;（2） β-折叠(β-pleated sheet) ; ?-折叠 ?-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。 ①在?-折叠中，?-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm. ② ?-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。 ③?-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。;β-折叠有两种类型;反平行式;平行式;（3）β- 转角(β- turn);β- 转角;（4）自由回转(random coil);超二级结构(supersecondary structures);第33页/共121页;结构域(domains)：;几种常见的结构域;第36页/共121页;蛋白质三级结构;第38页/共121页;蛋白质的四级结构;蛋白质的四种结构层次;;蛋白质分子结构与功能的关系;(一）蛋白质一级结构与生物功能;2、一级结构的关键部分相同，功能相同;3、一级结构改变引起的分子病：;蛋白质的空间结构决定于其一级结构和周围环境的影响 如：疯牛病;prion的发现，提示人们，一级结构和环境因素影响蛋白质的构象。;（二）蛋白质构象与功 能的关系;用化学方法修改Pr或多肽化合物的结构，可提高活性； 了解Pr结构中的活性必需片段，可人工合成Pr。;蛋白质的性质;渗透压法;分子量测定;SDS- PAGE;;第55页/共121页;;第57页/共121页;;Typical calibration curves obtained with standard proteins separated by nongradient denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis based on the method of Laemmli (1970). (A) Gel with 7% polyacrylamide. (B) Gel with 11% polyacrylamide. (Redrawn with permission from Sigma.) ;Separation of membrane proteins by 5.1% to 20.5% polyacrylamide gradient SDS;;分子量测定;分子量测定——超速离心法;分子量测定——超速离心法;分子量测定——凝胶过滤法;分子量测定——凝胶过滤法;第67页/共121页;分子筛— 凝胶过滤法;（二）两性电离与等电点;（三）胶体性质;（四）呈色反应;双缩脲反应;米伦氏反应 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应） 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热变成红色 乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸 坂口反应 精氨酸的反应（胍基的反应） 精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物 鉴定蛋