蛋白质理化性能与纯化.pptx

蛋白质理化性能与纯化;第六节;一、理化性质 ;（一）蛋白质的两性电离性质 ;（二）蛋白质的胶体性质 ;;（三）很多因素可引起蛋白质的变性; 造成变性的因素 温度（热、冷）加热； 强酸、强碱； 尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应）； 表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS）等; 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等； 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 ;复性(renaturation) ;;（四）蛋白质的沉淀作用; 1、可逆沉淀 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 ;盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象（水与离子的相互作用增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用；同时瓦解了以电荷为基础的蛋白质分子之间的作用）。 盐溶：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐溶。; 2、不可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。;（五）蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰;（六）蛋白质的呈色反应可用于溶液蛋白质测定;二、蛋白质的分离和纯化; 纯化的目标 尽量提高蛋白质的纯度或比活性，设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽可能提高蛋白质的产量。 ; 1）从组织细胞中溶解放出蛋白质，并保持天然状态，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌 酶破壁、破膜，再用溶剂提取。 2）分离所需要蛋白质与其他蛋白质 a 等电点沉淀 b 盐析和有机溶剂分级??离 ;4）结晶提纯 a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白； b 结晶的最佳条件：略过饱和溶液； 各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。 防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。 ;（二）透析及超滤法;透析的示意图;（三）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 ;将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 ;（四）利用荷电性质可将蛋白质采用 电泳法进行分离;*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS),常用于蛋白质分子量的测定; *等电聚焦电泳(isoelectric equilibrium electrophoresis,IEE)，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法; *双向凝胶电泳(two-dimentional gel electrophoresis,2-DGE)是蛋白质组学研究的重要技术。;电泳上样和电泳图;走电泳;;（五）应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离;离子交换色谱（ion exchange chromatography, IEC)； 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析(molecular sieve filtration)或体积排阻色谱（ steric exclusion chromatography）； 疏水相互作用色谱（ Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）； 亲和色谱（Affinity Chromatography，AFC)。 ;IEC是利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离; 凝胶过滤或体积排阻色谱（ SEC）或分子筛层析(molecular sieve filtration) 是利用各蛋白质分子大小不同分离；;HIC 是基于用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相分离；;AFC是基于固定相的配基与生物大分子之间的特殊的生物亲和能力的不同来进行生物大分子相互间的分离。;（六）利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离;离心机和离心沉降法分离蛋白质;分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成;通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列;氨基酸和肽末端测定法;离子交换色谱分析蛋白质的氨基酸组分;（八）应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测;2. 三维空间结构测定;3. 根据蛋白质的氨基酸序列