生物化学过氧化氢酶Km值测定.pptxVIP

生物化学过氧化氢酶Km值测定;一、实验目的;二、相关知识与原理;Km值的含义 Km值是酶的特征性常数之一 Km值可近似表示酶对底物的亲和力 同一酶对于不同底物有不同的Km值 测定Km是研究酶的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01∽100mmol/L之间。 ;双倒数作图法;实验原理;用不同的H2O2的起始量代表同一体系不同时刻的底物浓度。 根据不同的底物浓度和对应的反应速度绘制标准曲线。 从坐标图上读出-1/Km，计算Km值。;1、0.02mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.0 ）。 2、0.02mol/LKMnO4：称取 KMnO4 3.2 g，加蒸馏水 1000 mL，煮沸15 min，2d后过滤，棕色瓶保存 3、0.004mol/L KMnO4：称取恒重草酸钠0.2 g，加 250mL冷沸水及10mL浓硫酸，用0.02mol/L KMnO4 滴定至至微红色，加热至65 ℃，继续滴定微红色30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。 ;4、0.05mol/L H2O2:30% H2O2 23ml 加入1000ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，用 0.004mol/L KMnO4 标定其准确浓度 (标定前稀释4倍，取2mL，加25% H2SO4 2mL，用0.004mol/L KMnO4 滴定至微红色)。(标定0.05 mol/L H2O2的实际浓度为0.053mol/L) 5、25% H2SO4 ;1、酶液的制备： 每组(共分6组)称取马铃薯5g，加磷酸缓冲液 10mL，研钵匀浆，滤纸过滤。;2、反应速度的测定：取干燥的50-100ml锥形瓶6只，编号后按下表操作：;3、实验数据收集（根据实验进程填写下表）;注意事项;反应速度的计算 V = 加入的H2O2的毫摩尔数－剩余的H2O2的毫摩尔数/5min = H2O2的摩尔浓度×加入H2O2毫升数－0.004×2.5×消耗KMnO4的ml数/5min 注意硫酸和高锰酸钾使用安全！ ; 酶米氏常数的测定会受到那些实验条件的影响？;感谢观看！