流式细胞术的原理和临床.pptxVIP

第1页/共41页流式细胞术的原理和临床第2页/共41页溴脱氧脲嘧啶核苷替代胸腺嘧啶脱氧核苷参与DNA的合成，测定DNA的合成速率。异染性荧光染料AO，同染DNA、RNA识别G0/G1期。第3页/共41页二．测定细胞周期蛋白、癌基因及抗癌基因蛋白 对细胞周期调节机理研究进展较快，真核细胞的增殖是控制在细胞周期的特定阶段，特别是在G1到S期以及G2到M期移行部位。Cyclin（周期蛋白）作为Cyclin依赖性cdk复合体的调节亚单位，对细胞周期起重要的调节作用。第4页/共41页Cyclin家族中有8种CyclinA、B、C、D、E、F、J、H。Cyclin A、B、F及E在细胞周期中不间断的表达。这些蛋白质合成及降解构成了细胞周期的特征性。增殖细胞核抗原PCNA是一稳定的细胞周期相关性核蛋白，在G1期和S早期，PCNA水平升高2~3倍，在G2期保持低值。Ki-67核抗原可见细胞周期全过程，而静止期G0无表达。第5页/共41页C-erB-2，产物是分子量为190KD跨膜糖蛋白，其结构类似于表皮生长因子受体，过表达C-erb常常与肿瘤细胞较快增生及病人预后有关，使用FCM可测定C-erb-2在乳腺癌等中的表达，并可进而分析与病人预后的关系。 第6页/共41页MYC基因家族由C-MYC、N-MYC及L-MYC构成，也是与细胞增殖有关的癌基因，最近的研究提示MYC基因与凋亡的诱导有关。P53已被认为是一种抗癌基因。野生型P53蛋白是一种细胞生长抑制物，能阻断细胞周期循环。人类的许多恶性肿瘤中，可见P53突变，用FCM可以测定P53在癌细胞内表达，从而评估诊断和预后。 第7页/共41页P53 Tumour Suppressor Gene第8页/共41页Human p53 Protein –Antibody Mapping Sites第9页/共41页三．细胞内PH及Ca2+测定 Ca2+除了作为细胞内许多关键和功能蛋白的辅基之外，还是重要的细胞内信使，测定细胞内Ca2+的变化，对于了解细胞内信息传递，细胞调亡等都有一定的意义。使用Ca2+特异的Fluo—3染料标记细胞可用FCM测定Ca2+的变化。 用SNARF—1标记细胞，用FCM可测定细胞内PH，例如癌细胞在受到加热或化疗细胞内PH下降。第10页/共41页四．细胞凋亡研究上的应用 细胞死亡在多细胞生物通过两种机理而产生，即凋亡和坏死。凋亡不仅与个体形成等基本生命现象有关，而且与癌、AIDS等多种疾病的发生密切相关。电泳分析可见DNA呈阶梯状改变。使用FCM能精确定量凋亡细胞，同时可进行多参数分析。 第11页/共41页原位标记DNA断裂的方法已用来鉴别凋亡的细胞，使用生物素或地高辛标记的脱氧核苷酸在外源性DNA聚合酶或TdT作用下，标记3`-OH。荧光素标记的二抗与其结合，用流式细胞术检测凋亡细胞。第12页/共41页凋亡蛋白的检测： 反映细胞凋亡的早期蛋白Annexit V 其他P53蛋白、Myc蛋白、bcl-2蛋白、Bax蛋白等等。第13页/共41页五、多药耐药检测 近年来的研究发现癌细胞耐药性与癌细胞内存在耐药基因有关。多药耐药基因（multidrug resistant gene,MDR）的产物为P-糖蛋白（P-GP或P-170）。P-170是分子量为170KD的跨膜蛋白，利用ATP的能量将抗癌药物排出细胞外。除在正常细胞上表达外，常常在许多实体肿瘤细胞及白血病中高表达，提示耐药性增高。故对于肿瘤化疗病人，检测P-170有重要的临床意义，可指导癌症治疗。第14页/共41页用抗P-170抗体标记肿瘤细胞，用流式细胞术可直接测定P-170表达。也可用罗丹明荧光染料作为被测抗癌药物在细胞中的积聚。在耐药细胞有P-170糖蛋白的过表达，使进入细胞的罗丹明荧光染料可以被泵出细胞外，细胞内的罗丹明减少，荧光强度降低，可以用FCM检测。第15页/共41页流式细胞术在免疫学中的应用 一、细胞表面标记及抗原决定簇性质的研究 流式细胞术在细胞表面标记，特别是肿瘤细胞表面标记的研究中，以及在细胞分类和亚群的分析上，开始了一场细胞免疫学的革命。尤其在细胞表面标记分析上，占有举足轻重的地位。第16页/共41页1．1 血液系统细胞表面标记的研究 可用于白血病细胞的免疫分型和淋巴瘤的研究。1．2 细胞群体及细胞表面标记变化的检测 可以发现体内外细胞表型及细胞亚群的微小变化，有利于发现恶变的肿瘤细胞，或在免疫治疗及宿主排异反应中抗原决定簇发生改变的细胞群体。 第17页/共41页第18页/共41页1．3 细胞表面抗原决定簇性质研究1．4 细胞表面标记的分子变化的定量分析 1．5 细胞抗原表达的研究第19页/共41页 细胞抗原的表达和细胞的其他生物和生化变化一样，是细胞增殖和增殖活动中的一种现象。研究正