【DNA重组】分子生物学-11-2-酵母杂交等.pptx

;;; 典型的真核转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain,BD) 识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域(transcription-activating domain,AD) 转录激活结构域配合其他成分、构成转录复合体，启动基因的转录。 ;;6.3.1 酵母单杂交系统;报告基因 (reporter gene);单杂交系统的原理;;;;Different ORFs are expressed as fusion proteins to either the GAL4 DNA-binding domain (GAL4-BD) or its activation domain (GAL4-AD). If the proteins encoded by the ORFs do not interact with each other, the fusion proteins are not brought into close proximity and there is no activation of transcription of the reporter gene containing the upstream GAL4-binding sites. ;;酵母双杂交系统的原理-文字;具体实验过程：;Library-based yeast two-hybrid screening method.;酵母双杂交中常用的报告基因;酵母双杂交系统的载体 主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。 上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。 例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。;酵母双杂交的优点 ;假阳性的问题;假阳性的去除;;酵母双杂交系统的应用;②未知蛋白质的功能研究：;③克隆新基因、新蛋白：;例如，ThomSTon等以信号转导中的AMPK的催化亚单位(α2)为诱饵，筛选到一个AMPK调节亚单位β的异构体。Wible等以钾离子通道蛋白为诱饵，克隆了一个新的钾离子通道调节蛋白KchAP。;例如，ThomSTon等以信号转导中的AMPK的催化亚单位(α2)为诱饵，筛选到一个AMPK调节亚单位β的异构体。Wible等以钾离子通道蛋白为诱饵，克隆了一个新的钾离子通道调节蛋白KchAP。;④研究蛋白质相互作用网络;⑤药物筛选;6.3.3体外蛋白质相互作用技术简介;1、等离子表面共振技术;2、免疫共沉淀技术;;3、GST融合蛋白沉降技术;Pull-down 试剂盒;4. 细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件： （1）给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； （2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）； （3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 ;FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光 谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量 没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不 同，可根据需要组成不同的探针对。常用的 探针有： 荧光蛋白，一类能发射荧光的天然蛋白及其 突变体。 传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的 有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。 镧系染料，金属染料。一般与有机染料联 用，分别作为FRET的给体或受体，以提高检 测的准确性和信噪比。 ;5、Far Western blotting;;Far-western blotting与western blotting的区别;;;Far-western blotting;6.3.4 染色质免疫共沉淀;注意page226图6-30 注释文字有误，图片抄袭不清;6.3.5 RNA干扰技术page227，322;20