新一代基因测序技术.pptxVIP

新一代基因测序技术; 新一代基因测序技术(Next Generation Sequencing Technologies)是一系列在2004年后问世的新的DNA测序技术。这些新技术使用不同以往的化学测序法，依靠高度并行的基因序列读取方式，取得了令人难以置信的DNA测序高通量。新一代基因测序技术能在数天内完成第一代基因测序技术花费1O年完成的人类基因组测序。 ; 自2004年问世起，不断发展的新一代基因测序技术（NGS）在生物医学领域引发了许多突破性的发现，推动了基因组学的革命，促进新学科的创立，如个人基因组学，细菌基因组流行病学。 ; 基因测序技术起源与发展 新一代基因测序技术平台简介 新一代基因测序技术的临床应用 肿瘤分子诊断领域 肿瘤研究领域 遗传病筛查领域 传染病研究领域 细菌基因组流行病领域;基因测序技术起源与发展;Sanger测序法的局限性;自动化Sanger方法被认为是“第一代”基因测序技术 ;2004年起开始面世的一系列新的DNA测序技术有统一的名称—— “新一代基因测序技术”。事实上各种新一代基因测序技术的化学测序方法有着显著的不同，但是有3个共同特征 ：;NGS技术平台简介 ;;诺贝尔奖得主Frederick Sanger和Walter Gilbert ;;;Illumina的Genome Analyzer测序技术 对目标DNA的酶切短链进行扩增是通过桥式PCR来完成的。经过PCR扩增后，芯片上的目标DNA片段簇被用来做为模版来合成新的DNA链，四个差异化标记的荧光dNTP为每个目标DNA片段簇的复制提供原料。一旦单个dNTP被加入新合成DNA的末端，此dNTP的差异化标记荧光就会被读取并记录，由此实现边合成边测序。当DNA延伸步骤完成，测序仪所携带的电脑软件程序就会分析每个目标DNA簇的序列，并完成各个短链序列的对齐，以及目标基因组的组合 。;; 近年来，Illumina公司在基因测序仪行业一直占据主导地位，其产品占据60％市场份额。2010年推出的IlluminaGA测序仪，HiSeq2000,就是一个标准高通量大规模平行基因测序的典范。HiSeq2000一次测序耗时为10天，能完成600亿个碱基对的测序，试剂成本仅为24 000美元。Illumina公司在2011年推出的测序仪，MiSeq，针对较小的实验室和临床诊断市场，其数据输出量小于2010年推出的HiSeq200。 ;Biosystems SOLID 基因测序仪 该测序技术采用了独特的以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应为基础测序方法。具体操作也是开始于油包水PCR扩增连接在微珠上的目标DNA酶切短链。扩增后，用共价键把微珠及其扩增目标DNA短链连接到芯片表面，然后放置到SOLID基因测序仪的缓冲液测试槽内进行DNA测序。 ;;Pacific BioSciences公司的PacBio RS测序仪 采用荧光素标记的dNTPs进行单分子实时测序，又称为SMRT技术(single molecule，real-time)，因此该公司的PacBio RS为第3代DNA测序仪。 ;SMRT技术将DNA聚合酶固化在每个称为ZMW 的小池里，仅照射ZMW 底部30 nm的区域，实时检测荧光素标记的4种核苷酸掺入。利用其专有的SMRT 芯片(SMRT cel1)，内含约75 000个ZMW，因此可以同时对近75 000个单分子进行平行测序。不同于传统方法将荧光素标记在核苷酸碱基上，SMRT技术的核苷酸标记在磷酸链上，避免了染料基团干扰DNA聚合酶的活性；一个核苷酸掺入后，DNA聚合酶切断磷酸链，释放出染料分子，降低了干扰信号。这些技术保证了PacBio RS能够进行单分子实时测序，读长在1 000 bp以上，反应时间从30 min到1 d。 ;;Life Technologies公司／Ion Torrent PGM 测序平台 自然条件下，DNA聚合酶将1个核苷酸掺入DNA链中，就会释放1个H+ ，该 H+ 所带电荷改变了溶液的pH值，可供离子探头检测分析。 Ion Torrent测序又被标榜为第4代测序技术。 无需荧光物质标记和使用高清晰度摄像头，测序成本大幅降低，能在2～3 h内完成。 模板读长较短是其缺点。 ;;自2010年以来，使用新一代测序仪的临床试验数量有大幅度的增加。有全基因组测序，也有全外显子组测序，还有RNA测序和定向测序（targeted sequencing）。不论采取哪种测序