w细胞生物学研究方法.pptVIP

特点： （1）照明光源不同； （2）放大倍数的调节方式不同，是依靠改变磁透镜的微磁电流强度来调节放大倍数的，也就是说，电流强度的变化引起了磁场强度的改变，而磁场强度的变化又使电子射线的折射程度发生改变，因而放大倍数即随之出现变化； （3）有高压稳压系统，电子流的发射速度及波长皆取决于电压的高低。 通常透射电镜的电压达几万——十几万伏的高压； 目前三十页\总数七十九页\编于十七点 （4）有高度真空的工作系统。因为高速运动的电子流如果与空气中的微粒和分子碰撞就会改变它的发射方向，导致成像模糊，故要求电镜内的工作系统（包括样品室）都必须保持高度真空状态，并且样品都必须脱水（真空中水易蒸发or升华，电子流与水分子相碰，改变其方向，使成像模糊）因此说透镜电镜不能用来观察活的样品； （5）样品厚度必须900（即90nm,0.09um）这是因为电子穿透能力有限，样品过厚则成像不清晰，并且高速穿透的电子会产生热量，将原样品烧出白斑，所以透镜电镜观察的样品须超薄切片（400~500）不能用普通电镜下的组织切片（2~7um）； 目前三十一页\总数七十九页\编于十七点 （6）标本染色技术不同，电镜标本染色并不像光镜标本染色上各种颜色，而是使观察的结构与背景之间，黑白对比分明，反差强。所以电镜标本染色剂大多是重金属盐类。染色方法有正染、负染两类，正染常采用醋酸铀或柠檬酸铅染色，使得被观察的结构较暗，背景较亮；负染则是使用磷钨酸染色，使得背景较暗，而观察的结构显得明亮突出； （7）特殊的投影技术（真空喷镀法）是对电镜标本的表面处理技术，即以真空喷镀仪在真空条件下，将金、铂等金属微粒倾斜地喷向标本，使其朝向发射原的表面沉积的金属微粒多于背面，因而电镜观察时感觉反差极强，具立体感。 目前三十二页\总数七十九页\编于十七点 图2-15 肌动蛋白纤维的负染电镜照片 目前三十三页\总数七十九页\编于十七点 （8）冰冻蚀刻（或冰冻断裂）技术freeze etching or freeze-fracture 是研究细胞各种膜相结构的处理方法，先将样品放入-190℃低温下迅速冰冻，再在真空中用冷却刀切割断裂，随后上升温度，让冰在真空中升华成水汽跑掉，断裂面的细微结构暴露出来，再用真空喷镀仪在断面上喷一层碳膜或铂——碳膜（称为“表面复型膜”）然后拿出真空之外，用有机溶剂将样品溶解掉，置“表面复型膜”于铜网上，即可上电镜观察了，因此，电镜下看到的实际上已不是样品本身，而是样品某一断裂面的“人工复制品”，这是因为人为的这种表面变型膜能比生物样品本身有更强的电子反差性能，能够以富有立体感的浮雕形式精细地反映出某一断裂的细微结构。对于“冰冻蚀刻处理的生物膜各个面，国际上统一（规定命名称为PS”代表面向细胞质基质的表面）。 目前三十四页\总数七十九页\编于十七点 图2-16 冰冻蚀刻电镜照片 目前三十五页\总数七十九页\编于十七点 2、扫描电镜（scanning electron microscope SEM）： 工作原则不同于透射电镜，是以电子束在样品表面扫描，用闪烁器收集样品表面散射回来的二次电子信号，再经放大，最后在荧光屏上显示图像。 特点：不需要经过复杂处理，即可观察标本的原始外表面。 目前三十六页\总数七十九页\编于十七点 图2-17 JEOL 扫描电子显微镜 目前三十七页\总数七十九页\编于十七点 优点： （1）可观察较大，较厚的样品 （2）景深大（景深——聚焦后能清晰看到物象的前后距离范围），所以图像是十分逼真的三维立体形象 （3）其放大倍数是从20~20万倍的连续变倍，，不须重复多次对焦，故对观察研究很方便 （4）样品可在样品室内做多方位的水平移动和转动，便于从各个角度来观察样品的全貌。 缺点： （1）分辨力不太高，仅3~10nm （2）不能观察样品内部。 目前三十八页\总数七十九页\编于十七点 图2-18 光学显微镜、TEM、SEM 成像原理比较 目前三十九页\总数七十九页\编于十七点 图2-19 人类血细胞SEM 照片 目前四十页\总数七十九页\编于十七点 （三）扫描隧道显微镜（scanning tunnelling microscope STM） 特殊显微镜，不是电镜，是新型探测样品外表的纳米级微观形貌的高级仪器，具有三维立体扫描物体表面的原子尺度高分辨能力，并能在常规大气or液体条件下观测样品，无须强求真空环境，也不采用高能电子流攻击样品，故有利于观察样品的真实自然形态，这是目前开展纳米结构生物学研究的重要技术，已用于直接观察DNA分子，蛋白质分子及生物微精细结构。 目前四十一页\总数七十九页\编于十七点 扫描隧道显微镜原理 目前四十