外源基因在原核细胞中的表达.pptxVIP

第1页/共100页外源基因在原核细胞中的表达第2页/共100页第七讲 基因的表达、调节与产物纯化第3页/共100页第一节 外源基因在原核细胞中的表达第4页/共100页一、原核生物基因表达的特点1. 只有一种RNA多聚酶识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。2. 以操纵子为单位数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。第5页/共100页3. 转录和翻译偶联、连续进行。第6页/共100页第7页/共100页4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。6. mRNA的核糖体结合位点。Shine-Dalgarno（SD）sequence:含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（SD）序列。第8页/共100页二、原核表达系统的注意事项1. 外源基因不能带有内含子。2. 必须用cDNA3. 不能直接用真核基因组DNA。4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。第9页/共100页三、原核生物基因表达的调控1. 启动子是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。（1） 启动子序列大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。-35 Box 和-10 Box第10页/共100页第11页/共100页① -35 boxRNA聚合酶δ亚基的识别位点。 5’ –TTGACA- 3’② -10 box（Pribnow Box） 5’–TATAAT- 3’5’ TTGACATATAAT 转录起始位点17bp核糖体结合位点第12页/共100页第13页/共100页（2） 翻译的起始位点①核糖体结合位点（RBS）ribosome binding site1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：第14页/共100页2）起始密码：位于SD序列下游。AUG (91%) GUG ( 8% ) UUG ( 1% ) 第15页/共100页2. RNA多聚酶大肠杆菌只有一种类型的RNA 多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。结构全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。第16页/共100页启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子3. 转录终止子在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。内终止子intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。第17页/共100页原因：① 茎环结构反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作。② 多聚A/U由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。第18页/共100页第19页/共100页第20页/共100页4. 翻译终止密码大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。5. 翻译增强子Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。第21页/共100页6. 基因工程常用的原核启动子（1）最佳启动子必须具备的条件① 必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。② 应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。③ 应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。第22页/共100页（2）乳糖启动子lac来自大肠杆菌的乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。Plac O 目的基因第23页/共100页 调控区 结构基因DNAPOZYAZ： β-半乳糖苷酶Y： 透酶A：乙酰基转移酶操纵序列启动序列CAP结合位点第24页/共100页阻遏基因polDNAIPOZYAmRNA阻遏蛋白没有乳糖存在时第25页/共100页DNAIPOZYA启动转录mRNAmRNAβ-半乳糖苷酶pol阻遏蛋白半乳糖乳糖有乳糖存在时第26页/共100页第27页/共100页第28页/共100页第29页/共100页① 乳糖操纵子控制区的结构“可移动的lac启动子小片断”组成：阻遏物作用区CAP作用区RNA聚合酶作用区长度：203bp的HaeIII片断（包括β-半乳糖苷酶的前8个密码）。第30页/共100页大肠杆菌乳糖操纵子控制区的结构第31页/共100页第32页/共100页第33页/共100页第34页/共100页（3）色氨酸启动子trp来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。第35页