基因工程大肠杆菌克隆载体.pptxVIP

基因工程大肠杆菌克隆载体;所有克隆质粒中，最多的一类是以大肠杆菌为宿主的。 因为： 过去50年内，这种细菌在基础研究中一直扮演着中心角色； 已积累大量有关大肠杆菌的微生物学、生物化学和遗传学知识； 事实上所有关于基因结构和功能的基础研究都是以大肠杆菌为材料而开展的。;3.1 基于大肠杆菌质粒的克隆载体;3.1.1 质粒克隆载体的命名法;3.1.2 pBR322的一些有用特性;第6页/共80页;第二个优点是拥有两套抗生素耐药性基因 两个耐药性基因(氨苄青霉素耐药性和四环素耐药性基因)都可作为含有该质粒的筛选标志，而且每个抗性基因内都拥有一个限制性单酶切位点，这在克隆实验中非常有用。 用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会导致四环素抗性基因失活。 这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的DNA片段的导入。;第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数 通常在被转化过的大肠杆菌中有大约15个pBR322质粒分子； 在蛋白质合成抑制剂(如氯霉素)的存在下，通过质粒扩增，拷贝数可以增加到1 000-3 000。 这样，通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组过的pBR322质粒分子。;3.1.3 pBR322的家谱;第10页/共80页;3.1.4 其他大肠杆菌质粒克隆载体;pBR327—一个高拷贝数质粒;(2)1 089bp片段的删除，破坏了pBR322的接合能力，使pBR327不能把自己转移到另外一个大肠杆菌细胞中去。 这一点对生物防范很重要，避免了粗心的生物学家使重组后的质粒从试管和细菌植株中逸出。 相反，pBR322在理论上可以通过结合而进入天然的大肠杆菌细胞中去，虽然事实上pBR322也有一定的安全措施减少这种情况的发生。 当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选择pBR327。;第14页/共80页;pUC8—乳糖选择质粒;第16页/共80页;第一个优点 人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产生了一个偶然的突变，使得它在大肠杆菌内的拷贝数达到了500-700（扩增以前的数目）。 这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量的目的DNA。 第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青霉素和X-gal的琼脂培养基上。 而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种抗生素培养基平板。 一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322和pBR327要节约一半的时间。;第三个优点是pUC8拥有多克隆单酶切位点， 这使有两个不同黏性末端的DNA片段(比如一端是被EcoRI酶切过的，另一端是被BamHI酶切过的)可以直接被克隆，而不需求助于加入连接片段的操作。 其他的pUC载体，拥有不同的限制性酶切位点，具有更大的灵活性，允许更多种不同的DNA片段被克隆。 此外，这些载体中的限制性酶切位点与存在于M13mp 系列载体中的限制性酶切位点一样，可以很方便的进行DNA测序或体外诱变。;第19页/共80页;pGEM3Z—克隆DNA的体外转录;第21页/共80页;被pGEM3Z和其他同类载体所携带的启动子并不是被大肠杆菌RNA聚合酶识别的标准启动子。 实际上这些启动子有的被T7噬菌体编码的RNA聚合酶专一性识别，有的被SP6噬菌体编码的RNA聚合酶专一性识别。 当大肠杆菌被其中某种噬菌体侵染时就合成这些RNA聚合酶，用以转录噬菌体基因。 之所以在体外转录系统中选择病毒RNA聚合酶，是因为它们有着相当高的酶活，因此噬菌体基因一定能够很快被转录出来，能够在每分钟合成1-2μgRNA，比标准的大肠杆菌RNA聚合酶高效得多。;3.2 基于M3噬菌体的克隆载体;噬菌体，如M13的复制情况就较为复杂。 噬菌体的DNA分子通常带有几个为复制所必需的基因，包括编码噬菌体蛋白外壳的组分的基因和编码噬菌体特有的复制酶的基因。 改变或是删除这些必需基因中的任一个，都会损伤或是毁坏噬菌体的复制能力。 因此可供改变噬菌体DNA分子的自由度很小，而通常的噬菌体载体与原始分子的差别很小。;以M13噬菌体为例，可以看出构建噬菌体克隆载体的难度。 一个正常的M13噬菌体的基因组是6.4kb，为紧紧挤在一起的10个基因所占据，每一个基因对噬菌体的复制都是必需的。在基因间只有一个仅长507bp的短序列，新的DNA必须从这里插入才不会损伤其他基因，还必须保证同样处在这个短序列中的复制起点不被破坏。 所以，只有一个很小的空间用于改造M13噬菌体。 然而，M13有一个很吸引人的优点：它使人们可以获得单链的被克隆DNA。;第26页/共80页;第27页/共80页;3.2.1 M13mp2克隆载体