牙髓间充质干细胞生产.docx

牙髓间充质干细胞生产 目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程; 范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员; 职责： 生产主管负责本制度的执行和监督； 技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作； 监督员负责全程监督,并即时按要求填写牙髓间充质干细胞生产记录和生产试剂耗材记录表; 附表1牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录 附表2生产试剂耗材记录表 规程： 一、牙髓间充质干细胞原代操作 消化法： 1.仪器耗材 110ml移液管 培养皿 50ml离心管 100μm筛网 T75培养瓶 15ml离心管 2.试剂 1生理盐水 2培养基 3胶原酶 3.酶消化法操作流程 3.1将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出,吸取运输液4ml交给质检,并填写样本取样单,牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 3.2取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍,用止血钳固定牙冠,持骨钳夹碎牙根部,暴露出牙髓,用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 3.3用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3,转移到50ml离心管中,加入生理盐水至30ml,再加入10ml0.2%胶原酶； 3.4置于37℃恒温摇床,180rmp消化30min； 3.5用100μm滤网过滤； 3.61200rpm离心10min,吸取洗涤液4ml交给质检,并填写样本取样单； 附表3样本取样单 3.7弃剩余上清,调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃,CO2培养箱中进行培养; 4.组织块法操作流程： 4.1将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出,吸取运输液4ml交给质检,并填写样本取样单,牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 4.2取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍,用止血钳固定牙冠,持骨钳夹碎牙根部,暴露出牙髓,用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 4.3用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3,将组织块均匀铺到T25培养瓶用适量FBS润湿瓶底瓶底； 4.6倒置培养瓶,并加入5ml培养基,放入培养箱中培养； 4.712-24h后,将培养瓶轻轻翻转,将牙髓组织块浸入工作液中; 二、牙髓间充质干细胞换液 1.耗材 110ml移液管 215ml离心管 2.试剂 培养基 3.操作流程 3.1镜下观察状态细胞； 3.2吸取上清液4ml交给质检,并填写样本取样单； 3.3吸取上清液于50ml离心管中留作精华液原代培养上清不留,并补充新的培养基； 3.4观察细胞并将其置于37℃,5%CO2孵箱中培养; 三、牙髓间充质干细胞传代培养 1.耗材 110ml移液管 250ml离心管 培养瓶 15ml离心管 2.试剂 1生理盐水 2胰酶 3血清 4培养基 3.操作流程 3.1显微镜观察,观察培养瓶中的细胞密度到达80%—90%,可进行传代培养； 3.2吸取上清液于50ml离心管中留作精华液原代培养上清不留,T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤贴壁细胞； 3.3吸取洗涤液4ml交给质检,并填写样本取样单； 3.4倒出剩余洗涤液生理盐水,再加入10ml生理盐水+0.05%胰酶,进行细胞消化,消化的第一瓶镜下观察,细胞收缩即可加入等体积血清终止消化； 3.5将细胞收集到50ml离心管中,1200rpm,6min,弃上清,重悬,加入培养基,然后按照1:2或1:3进行传代; 四、牙髓间充质干细胞成品制备 1.耗材 110ml移液管 250ml离心管 315ml离心管 4西林瓶/输血袋 2.试剂 1生理盐水 2胰酶 3血清 4干细胞保存液 3.操作流程 3.1待细胞扩增总数达所需细胞数量后,吸取上清液于50ml离心管中留作精华液原代培养上清不留,T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤一遍； 3.2加入10ml生理盐水+0.05%胰酶,进行细胞消化,消化的第一瓶镜下观察,细胞收缩即可加入等体积血清终止消化； 3.3将细胞收集到50ml离心管中,1200rpm,10min； 3.4弃上清,细胞沉淀用30ml生理盐水洗涤二次,1200rpm,室温离心10min; 3.5取第二次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分,并填写样本取样单； 3.6用干细胞保存液/生理盐水重悬细胞,转入专用的无菌西林瓶/生理盐水中,封口,贴标签,放置4℃保存; 3.7完成初包装后,操作员立即将成品送交包装部门; 牙髓间充质干细胞的冻存 1.耗材 110ml移液管 250ml离心管 315ml离心管 4冻存管 2.试剂 1生理盐水 2胰酶 3血清 4冻存液 3.操作流程 3.1将制备好的MSC于1200rpm室温,离心10min; 3.2弃去上清,将细胞悬浮于适量冻存液中,使细胞浓度在107个细胞/毫升,置于低温无菌冻存管中; 3.3将细胞交给库管