NDM基因的检测与确认.pptxVIP

NDM基因的检测与确认第1页/共15页 NDM-1的基因检测PCR检测序列测定——最终确认检测对象：已经过表型筛检的菌株进行NDM-1基因确认对大批菌株直接进行筛检对标本的检测高通量、快速、准确第2页/共15页 PCR检测方法——模板制备模板制备：菌株、标本菌株（1）G-细菌： a. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200μl纯水 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清，-20 ℃保存 b. 试剂盒提取基因组DNA（说明书）第3页/共15页 PCR检测方法——模板制备菌株（2）G+细菌： a. 试剂盒提取基因组DNA（说明书） 溶菌酶充分作用 b. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200 μ l纯水 低温反复冻融（-40 ℃以下或液氮） 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清，-20 ℃保存2. 标本：根据标本类型不同选择相应的试剂盒第4页/共15页 PCR检测——引物选择引物选择：扩增片段位于CDS正向的191-482位置（反向345-636位置） 483-769位置（反向58-344位置）引物特异性较好，理论上无非特异扩增片段引物引物序列（5 ＇→3＇）产物大小（bp）退火温度(℃)引物117U-191CAGCACACTTCCTATCTC2925517L-465CCGCAACCATCCCCTCTT引物2F-58GGCGGAATGGCTCATCACGA28660R-344CGCAACACAGCCTGACTTTC第5页/共15页 PCR检测——PCR体系引物合成稀释冻干粉末，开启前10000rpm离心5min小心开盖，防止粉末喷出1.0OD+268 μ l纯水，充分震荡混匀 ，浓度20 μ M（20 μ mol/L）20 μ l体系（右图）若使用含有Mg2+的10×buffer的加入量同上表，MgCl2体积用水补齐 PCR Premix预混液（根据说明书）成分体积（μl）10×buffer2dNTP （10mM each）1.6MgCl2 （2.5mM）1.2Primer-F（20μM）1Primei-R（20μM）1Taq（5U/μl）0.2纯水12DNA1ng总体积20第6页/共15页 PCR检测——PCR体系没有阳性对照，如何确保体系正常运转同批 配置体系时：增加1管不使用NDM-1引物 加入常用引物及模板，扩增其他已知片段人工合成长片段DNA作为阳性对照？？ 不建议合成：首次发现时如何排除“污染”质疑 如果一定要合成：在中间区域加入若干数量的突变位点 作为区别合成片段与实际阳性片段的标志第7页/共15页 PCR检测——PCR反应条件与电泳反应条件：（约耗时1小时25分钟）94℃ 5min94℃ 15secTm℃ 30sec 25个循环72℃ 30sec72℃ 5min电泳：1.5%琼脂糖电泳 marker：DL2000第8页/共15页 基因序列测定——最终确认PCR阳性结果：携带NDM-1基因 非特异扩增最终确认：序列测定测序公司，当天得到结果测序样品：100 μ l以上PCR产物引物及其浓度：上下游引物各10 μ l（20uM）测序要求：双向、测通，提供拼接好的序列 第9页/共15页 基因序列测定——测序结果判读测序彩图：峰体清晰、无套峰第10页/共15页 基因序列测定——测序结果判读双向测序结果拼接起始段结果（10-30bp）、反应结果段结果（500bp）不可用第11页/共15页 基因序列测定——序列比对下载参考序列： Genbank：FN396876.1 /nuccore/255031061 AB571289、HQ171206、HM853678将测度序列与参考序列比对：