医学保健基因操作的主要技术原理.pptxVIP

医学保健基因操作的主要技术原理;核酸的凝胶电泳 扩增原理 分子杂交 测序;核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,同时也是分子生物学研究方法的技术基础。 ;基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链,依靠无反应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液,在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异,以及所带电荷的不同,可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。 ;电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子,比分子量较大的DNA分子迁移率要快;同等分子量的不同构型的核酸分子,构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快 ;凝胶电泳的分辨力: 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间 ;琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼脂糖。 ;LMP琼脂糖 熔点:62～65℃ 熔解后,在37℃ 可保持液态数小时; 在25℃ 可保持液态约10min ;回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化; 加入过量的酚抽提DNA; 离心获得含DNA分子的上清液; 直接酶切 ;琼脂糖凝胶电泳的参数: 缓冲液:1× TAE(TBE TPE) 凝胶的含量:根据检测的DNA大小 加DNA样品:1μg,指示剂 电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短时间 染色和观察:溴化乙锭(ethidium bromide,EB)染色,在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪)。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比 ;Separation Range Vs. ﹪ Agarose;第12页/共102页; 用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算 ;;;Agarose gel electrophoresis;Agarose gel electrophoresis;聚丙烯酰胺凝胶电泳 缓冲液:TBE 凝胶聚丙烯酰胺:丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺(29:1);TEMED和过硫酸铵( 10％ )。 ;PolyAcrylamide Gels;脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 1984年,D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向与核酸??移动方向成45 ℃角,下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角,由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比,分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 ;在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角,下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角,由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比,分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 107bp的DNA大分子。 ;PFGE can resolve large DNA fragments;基因扩增(gene amplification) 主要内容: 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化,将目的基因在宿主细胞进行扩增 3.在环境作用下,生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增;PCR技术 在1983年,美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,有称之为体外扩增法。;;;Reaction Condition for a Typical PCR Assay;Typical PCR Thermal Profile;Some DNA Polymerases Used in PCR;Characteris