血浆总蛋白的测定及白球比例的测定.pptxVIP

血浆总蛋白的测定及白球比例的测定第1页/共19页第2页/共19页血液·血浆·血清血液包括血浆和血细胞血浆是血液的重要组成部分，为淡黄色液体血清为血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白后得到的淡黄色透明液体第3页/共19页总蛋白测定及白蛋白测定实验目的：熟悉血清蛋白的测定方法（双缩脲法）。掌握血清总蛋白测定的临床意义。进一步巩固掌握721E型分光光度计的使用。熟悉血清白蛋白的测定方法（溴甲酚绿法）。掌握血清白蛋白的测定和白蛋白和球蛋白的含量比（A/G）测定的临床意义。第4页/共19页实验原理（总蛋白）双缩脲法的原理：双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。第5页/共19页蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。反应生成紫红色配合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与蛋白质的含量成正比关系，故双缩脲反应可作为蛋白质测定的依据。双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反映！凡分子内含有2个或2个以上甲酰基氨基（-CONH2-）均可呈双缩脲反映。第6页/共19页凯式定氮法测定化合物或混合物中总氮量的一种方法，即在催化剂条件下，用浓硫酸将有机氮转化为无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，然后用过量的酸液吸收用标准碱滴定，这样就可以算出样品 中的总 氮量。由于一般氮元素质量占蛋白质质量的 16% ，故样品中蛋白质含量=含氮量*6.25第7页/共19页实验试剂生理盐水：NaCl 0.9g 溶于100ml蒸馏水双缩脲试剂：硫酸铜 3.0g溶于500ml蒸馏水，加酒石酸钾钠9.0g,碘化钾5.0g，完全溶解后，加入24%NaOH100ml，用蒸馏水稀释到1L，置聚氯乙烯瓶内盖紧保存。蛋白质标准液：收集混合血清，经凯氏定氮法定值，用作蛋白质标准液。贮于冰箱中备用。也可用100mg/ml牛血清白蛋白替代。待测血清用生理盐水1:10稀释。第8页/共19页实验操作取3支试管，按下表操作。测定管 标准管 空白管 血清（ml）1.00——蛋白质标准液（ml）—1.00—生理盐水（ml）——1.00双缩脲试剂（ml） 5.0 5.0 5.0 第9页/共19页混匀，37℃水浴放置10分钟，以空白管调零点，在540nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。计算公式（P65）第10页/共19页实验原理白蛋白具有与阴离子染料结合的性质，在PH=4.2的环境中，带正电荷的白蛋白（PI=4.9）与阴离子染料溴甲酚绿（BCG）结合，由黄色变成蓝绿色。蓝绿色的深浅与白蛋白的浓度成正比，在波长620纳米处有光吸收峰。因此，应用BCG法可以直接测定血清白蛋白的含量。试剂中加入非离子型表面活性剂,可提高蛋白质与染料的结合力和溶解度。第11页/共19页试剂1.溴甲酚绿（BCG）贮存液 取BCG 419mg，用10ml 0.1mol/L NaOH溶解，加NaN3 100mg ，定容至1000mL。贮于棕色瓶备用。如用溴甲酚绿钠盐应称取432mg.加水溶解。2.0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.2）分别配制0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠溶液，然后按12.3：7.7的体积比例混合。每1000ml混合液加入NaN3 100mg。3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液 取Brij-35 30g,加少量水，60℃水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween-20或Tween-80代替)。4.BCG应用液BCG贮存液250ml，0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.2)750ml,30%Brij-35 8ml(也可以用Tween-20 8ml或Tween-80 10ml代替）混合而成。5.标准蛋白溶液（10mg/ml)称取人白蛋白1.00g，用生理盐水第12页/共19页1.白蛋白标准曲线绘制 取4支试管，按下表稀释标准液：1234白蛋白标准液 （ml)0.100.200.400.60生理盐水(ml)0.900.800.600.40稀释后白蛋白含量（mg/ml)1.02.04.06.0第13页/共19页注意事项1.由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示。2.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能防止两价铜离子还原3.高脂，黄疸及溶血标本应作清空白对照来校正误差。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色．4.血清白蛋白浓度＞100g/L时，需作稀释处理，结果乘上稀释倍数．第14页/共19页2. 血清白蛋白测定用生理盐水按1：10的比例稀释血清，取稀释后的血清0.2ml加入BCG应用液5.0ml混匀后立即同上比色，读取光密度，并从标注曲线上查出相应的白蛋白浓度。3.白蛋白/球蛋白比值（A/G比值）用双缩脲法